Desarrollo y optimización de un método de evaluación de genotoxicidad de fármacos (frecuencia de micronúcleos) en ratones Balb/c.”

BELTRAMINO MF; GASSER F; REBELINDO E; TABORDA P; SALINAS F; SIMONETTO C; ORTEGA H.H.; BARAVALLE M.E

Esperanza, Santa Fe

Jornada; XI Jornada de Difiusión de la Investigación y extensión; 2023

Facultad de Ciencias Veterinarias FCV_UNL

La genotoxicidad es la capacidad relativa de un agente de ocasionar daño en el material genético, originando efectos biológicos adversos no sólo al ADN, sino también a todos aquellos componentes celulares que se encuentren relacionados. Para su estudio, existen diferentes tipos de biomarcadores dentro de los cuales se encuentra el ensayo de evaluación de frecuencia de micronúcleos. El ensayo de micronúcleos es un biomarcador utilizado tanto en ensayos in vivo como in vitro, ampliamente aplicado en la epidemiología molecular y en la evaluación de los daños citogenéticos en poblaciones expuestas a agentes genotóxicos. El término micronúcleo (MN), hace referencia a los fragmentos acéntricos expulsados del núcleo principal en fases tardías de anafase. Los MNs pueden formarse a través de dos mecanismos tales como roturas cromosómicas (clastogénesis) o disrupción del aparato mitótico (aneugénesis)2. El ensayo de micronúcleos es ampliamente usado como una herramienta de selección para determinar la seguridad de muchas sustancias y clasificar a los agentes como posibles cancerígenos o no cancerígenos1. Cuando los eritroblastos de la médula ósea del ratón se transforman en eritrocitos policromáticos, el núcleo principal es expulsado y el micronúcleo formado, permanece en el citoplasma. En esta etapa, resulta factible visualizar los micronúcleos en estas células, debido a que carecen de núcleo principal. En este contexto, el aumento de la frecuencia de micronúcleos en los eritrocitos policromáticos de animales tratados es indicativo de la existencia de lesiones cromosómicas inducidas3. El presente trabajo tuvo como objetivo la evaluación de genotoxicidad de ciclofosfamida utilizada como agente genotóxico control y analizar el daño al ADN mediante un ensayo citogenético de evaluación de la frecuencia de micronúcleos. También se comparó el daño genotóxico espontáneo e inducido por ciclofosfamida en la cepa de ratones.Para ello se utilizaron 9 ratones machos de la cepa BALB/cCmedc de 8 semanas de edad. El protocolo fue previamente aprobado por CAES (FCV-UNL) bajo el n° 715/22. Los animales se dividieron en 3 grupos de 3 animales a los cuales se les administró por vía intraperitoneal, solución fisiológica al grupo A (grupo control negativo y para la evaluación de daño genotóxico espontáneo), ciclofosfamida (Microsules) en una dosis de 50 mg/kg al grupo B y ciclofosfamida en una dosis de 100 mg/kg al grupo C. Luego de 24 h se tomaron muestras de médula ósea. El espacio medular se lavó con suero fetal bovino (SFB, Internegocios), se centrifugó para obtener el pellet celular y se resuspendió en SFB. La suspensión de células se dispensó en 3 portaobjetos por animal y se realizaron extendidos. Se secaron a temperatura ambiente y se procedió a teñir utilizando May Grunwald Giemsa (Biopack). Para el estudio de la frecuencia de micronúcleos se observaron los preparados en microscopio óptico (60X), se tomaron 100 imágenes digitales para cada animal y se cuantificaron 2000 eritrocitos policromatófilos por animal. La frecuencia de micronúcleos se expresó como el porcentaje de MN: EPC (Eritrocitos policromatófilos) con micronúcleos sobre el total de EPC. Además, se obtuvieron datos sobre la relación entre eritrocitos inmaduros y eritrocitos maduros (EN: Eritrocitos normocromatofilos) y la relación de EPC sobre los eritrocitos totales, como índice de citotoxicidad 4. Como resultado, se observó diferencia significativa en el porcentaje de MN entre el grupo control y los grupos tratados con ciclofosfamida (p