DINÁMICA DE LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL DE DOS CEPAS DE Babesia bigemina CON DIFERENTE FENOTIPO, EN BOVINOS

THOMPSON, C.; BARAVALLE ME; VALENTINI, B; TORIONI DE ECHAIDE, S; ECHAIDE, I.

Santiago, Chile

Congreso; XX Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias; 2006

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO. Babesia bigemina es un hemoparásito Apicomplexa, transmitido en Argentina por la garrapata Riphicephalus microplus, capaz de causar anemia y muerte. Los bovinos que sobreviven, mantienen infecciones persistentes, que generan inmunidad para toda la vida útil. Para su prevención en Argentina se utiliza una vacuna basada en una cepa atenuada que induce inmunidad similar a la adquirida naturalmente. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las infecciones inducidas por dos cepas de  B bigemina  con diferente fenotipo. MATERIALES Y MÉTODOS. Se evaluaron dos cepas de B. bigemina multiplicadas in vitro, en bovinos normales. Dosis de 107 eritrocitos parasitados con las cepas BbiS1A, usada como vacuna y la BbiS2P, patógena, fueron inoculadas en bovinos agrupados en G1 (n=5) y G2 (n=6) respectivamente. Las infecciones se confirmaron mediante la observación microscópica de extendidos de sangre teñidos según Giemsa entre los días 6 y 12 post inoculación (PI). Cada 30 días se tomaron muestras de sangre con y sin anticoagulante, desde el mes 0 hasta los 12 meses PI (MPI) para el G1 y hasta los 9 MPI para el G2. Para identificar ADN de B. bigemina se realizó PCR en muestras de sangre. Se usaron los primers IAF/IBR (Figueroa et al 1992) y B269F/B822R (Hötzel et al 1997) en pruebas simultáneas y se incluyeron, ADN de B. bovis y H2O destilada (controles negativos). Se programaron 50 ciclos con temperatura de hibridación variable desde 67°C hasta 57°C. Los productos de la PCR se observaron en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. Para evaluar la dinámica de los anticuerpos, los sueros se analizaron mediante un ELISA basado en antígenos solubilizados de merozoitos purificados (ELISA-MZ) y un kit comercial basado en la proteína recombinante P200 de B. bigemina (ELISA–P200) (SVANOVIRTM). Para determinar la sensibilidad (S) y especificidad (E) de ambas pruebas, se analizaron 25 muestras de suero de bovinos infectados con B. bigemina, 41 de bovinos inoculados con B. bovis y 30 de bovinos nacidos y criados en zona libre de R. microplus. RESULTADOS. La infección de B. bigemina fue confirmada en todos los bovinos inoculados con la cepa BbiS1A (parasitemias <1%) y los infectados con BbiS2P (parasitemias > al 1%). La PCR amplificó las secuencias específicas para B. bigemina en los bovinos de ambos grupos, con los dos pares de primers. No hubo amplificación a partir del ADN de B. bovis ni del H2O. La PCR con los primers IAF/IBR generó productos de menor intensidad pero con mayor sensibilidad que con los primers B269F/B822R. Los productos originados por la cepa patógena mostraron bandas nítidas y constantes hasta los 8 meses PI, mientras que las generadas por las cepas atenuadas, mostraron fluctuaciones de intensidad con ausencias temporarias de producto. Las infecciones con ambas cepas de B. bigemina indujeron elevados niveles de anticuerpos entre los 2 y 5 MPI, luego se produjo un marcado descenso y la detección fue intermitente, aún cuando la PCR fuera positiva. La S y E para ELISA-MZ fue del 92 y 90%, mientras que para ELISA–P200 fue del 60% y 71% respectivamente. Entre los 2 y 5 MPI ELISA-MZ detectó entre el 80 y 100% de los bovinos infectados con BbiS1A y entre el 50 y 83% de los infectados con BbiS2P, mientras que ELISA–P200 detectó entre el 40 y 60% en el G1 y entre el 17% y 67% en el G2. Entre los 6 y 12 MPI, la detección de positivos en los bovinos inoculados con la cepa BbiS1A varió entre el 20% y el 80% con ELISA-MZ, y entre el 0% y 40% con ELISA–P200. Para los bovinos inoculados con BbiS2P, para este mismo período, la proporción de positivos varió entre el 50 y 63% con ELISA-MZ, y entre el 0% y 40% para ELISA–P200. CONCLUSIONES: La cepa patógena indujo infecciones persistentes con niveles de parasitemia detectables en forma constante por PCR, y niveles de anticuerpos con marcadas fluctuaciones de 3 meses de duración y tendencia negativa. La cepa atenuada generó parasitemias detectadas por PCR en forma intermitente y un nivel de anticuerpos elevado caracterizado por una meseta que persistió entre 5 y 7 MPI. La PCR con los primers IAF/IBR resultó el método más sensible para detectar infecciones únicas persistentes con B. bigemina durante 8 MPI. ELISA-MZ fue más eficiente que ELISA–P200, y sería de utilidad hasta los 5 MPI, para evaluar la eficacia de la vacuna basada en la cepa BbiS1A. Palabras clave: Babesia bigemina, PCR, ELISA, diagnóstico, infecciones únicas.