Caracterizacion de flavonoides sulfatados en extractos de Flaveria bidentis mediante la puesta a punto de un procedimiento analítico

FALLETTI P.; CABRERA JL.; COMINI LR .

Carlos Paz

Congreso; IV Reunión Interdisciplinaria de Tecnología y Procesos Químicos; 2018

Comite Organizador del Evento

Flaveria bidentis (L.) Kuntze (Asteráceas), es una especie vegetal de amplia distribución en América, creciendo principalmente en suelos fértiles (Agnese et al., 1999). Se destaca por ser la única especie que sintetiza derivados de quercetina con el más alto grado de sulfatación conocido. Los principales constituyentes de sus hojas son: 3,7,3´,4´-tetrasulfato de quercetina (QTS) y 3-acetil-7,3´,4´-trisulfato de quercetina (ATS), conteniendo además otros derivados mono y di sulfatados de quercetina. Conjuntamente con ellos, en hojas y flores, se encuentran flavonoides aglicones como kaempferol (Kp) y quercetina (Qt), y sus derivados glicosilados: 3-glucósido kaempferol (3GKp) y 3-glucósido quercetina (3GQt) (Cabrera, 1977). Se ha demostrado que los flavonoides sulfatados aislados de F. bidentis tienen propiedades anticoagulantes y antiplaquetarias, ligadas a la prevención de formación de trombos en diversas patologías (aterosclerosis, ataques cardíacos, ACV, entre otros) (Guglielmone et al., 2012). También se demostró que, principalmente quercetina, QTS y ATS, inhiben la actividad de la enzima aldosa reductasa, actuando en la prevención de la formación de cataratas en pacientes diabéticos crónicos (Chaudhry et al., 1983). Por lo tanto, la obtención de estos principios activos (PAs) desde la matriz vegetal, tiene un real impacto en la salud humana y en la industria farmacéutica. En este sentido e independientemente de la técnica de extracción utilizada (convencional o alternativa), es relevante la puesta a punto de un procedimiento analítico que permita identificar y valorar los flavonoides sulfatados presentes en extractos de F. bidentis, siendo éste el objetivo del presente trabajo. F. bidentis fue recolectada, en Córdoba, a fines de marzo de 2017, sobre la ruta que une Cruz del Eje-Deán Funes. Su identificación fue realizada empleando muestras de herbario y bibliografía científica apropiada, y su preparación, siguiendo las prácticas de desecado y conservación más apropiadas para esta especie vegetal (Villar del Fresno, 1999). Las partes aéreas de F. bidentis (hojas y flores, 14.85g y 17.18g respectivamente), fueron sometidas, por separado, a la técnica de extracción convencional (reflujo) utilizando como solvente de extracción agua:etanol (1:1), obteniéndose de esta manera, los extractos respectivos (extracto de hojas: EH y extracto de flores: EF). La posterior reducción del solvente de extracción casi a sequedad, sumado a la adición de etanol en exceso permitió, sólo en hojas, la obtención de un precipitado que fue separado del sobrenadante (SOEH) por medio de centrifugación. Una porción del precipitado fue disuelta en agua destilada y sembrada en una columna cromatográfica conteniendo geles filtrantes como fase estacionaria, logrando de esta manera la elución y recolección de dos fracciones (FA y FB). Posteriormente los EH y EF, junto a las fracciones y al sobrenadante (FA, FB y SOEH), fueron caracterizados químicamente por el procedimiento analítico diseñado y detallado debajo.Tras una búsqueda bibliográfica exhaustiva se utilizó como referencia la metodología reportada por Li et al., 2012, que emplea cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) como procedimiento analítico para la identificación de flavonoides no sulfatados. A partir de esta metodología, se llevaron a cabo las modificaciones necesarias a fin de poner a punto un método analítico que permita una óptima resolución cromatográfica de todos los flavonoides (sulfatados y no sulfatados) presentes en los extractos/fracciones obtenidas de F. bidentis. Así, el procedimiento analítico (CLAR) se llevó a cabo utilizando un cromatógrafo Varian Pro Star (modelo 210, serie 04171), equipado con un detector UV-Vis y una columna Hypersil 5 C18 (30 x 4.6mm, Phenomenex) mantenida a 25 ºC. Como fase móvil se utilizo A: agua (ácido acético 1%, v/v) y B: metanol (ácido acético 1%, v/v). El gradiente de disolventes y flujo empleado, se muestran en la tabla 1.Previo a su análisis por CLAR, las muestras fueron filtradas, empleando como volumen de inyección: 20L, y 290 nm como de medición. Utilizando esta metodología puesta a punto, los testigos (aislados y purificados previamente de F. bidentis por nuestro grupo de trabajo) fueron analizados por separado y luego conjuntamente (mezcla de testigos), determinando los tiempos de retención (tR) y la resolución entre ellos. Posteriormente se realizó el análisis cualitativo de los distintos extractos/fracciones, comparando los tR de los flavonoides presentes, con los tR de los testigos. La metodología CLAR puesta a punto, permitió la separación de la mayoría de los flavonoides presentes en la planta. Por lo tanto, este procedimiento analítico es adecuado para identificar la presencia de flavonoides sulfatados y no sulfatados en extractos obtenidos a partir de F. bidentis. De esta manera, estos resultados servirán de base para la identificación y cuantificación de dichos PAs en extractos obtenidos, aplicando distintas metodologías de extracción.