Efectos de la infección del Virus de la Leucosis Bovina (BLV) sobre una línea celular epitelial mamaria bovina (MAC-T): resultados preliminares

CUESTA, LUCÍA MARTÍNEZ; NIETO FARÍAS, M. VICTORIA; LENDEZ, PAMELA A.; DOLCINI, GUILLERMINA; CERIANI, MARIA CAROLINA

Buenos Aires

Otro; XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2016

Sociedad Argentina de Virología

INTRODUCCION: El virus de la leucosis bovina (BLV) es un retrovirus ampliamente distribuido en los tambos de nuestro país (1). Infecta principalmente linfocitos B y la transmisión ocurre por contacto con células infectadas. La infección viral se ha asociado a una disminución en la producción de leche y a un aumento en la susceptibilidad a otras infecciones como la mastitis, de ahí la importancia de evaluar el efecto del virus sobre células de epitelio mamario bovino. El objetivo de este trabajo fue infectar la línea celular MAC-T con BLV y evaluar los cambios en la expresión de TNF-α y del receptor tipo I de TNF-α (TNF-RI), cuyo desbalance se ha asociado con la progresión de la infección viral. (Konnai et al., 2005; Usui et al., 2006). MATERIALES Y METODOS: Se obtuvieron 60 ml de sangre entera anticoagulada con cirtato de sodio de un bovino infectad con BLV que presenta alta carga proviral. Se obtuvieron los PBMC mediante el método de Ficoll-Histopaque. Los PBMC se incubaron 24 hs con la línea celular MACT, luego de lo cual se retiró el medio de cultivo y se realizaron lavados con PBS. Las células fueron tripsinizadas para eliminar PBMC que se pudieran haber pegado a la placa. Luego de 10 pasajes se extrajo ADN de las células (en adelante MACT-BLV) utilizando un kit comercial (Quiagen). El ADN se utilizó como templado en una nested PCR para el gen env del BVL. Como control positivo se utilizó ADN de FLK. Como control negativo se usaron las MACT. Se realizó un WesternBlot para detectar la proteína viral p24 en el sobrenadante de cultivo de MACT, MACT-BLV y FLK como control positivo. Se realizó una cuantificación relativa del ARNm de TNF-α y TNF-RI bovino por PCR en tiempo real, utilizando SybrGreen y el equipo ABI Prism® 7500 Fast Real-Time. Los resultados se analizaron con el programa Rest ®.RESULTADOS: En la nested-PCR se observó una banda específica de entre 400 y 500 pb en las MACT-BLV y en el control positivo, compatible con el fragmento buscado del gen env de 444 pb. En el WesternBlot se observó una banda de aproximadamente 24 kDa en el sobrenadante de MACT-BLV y FLK, compatible con la proteína viral p24. En la PCR en tiempo real se observó que las MACT-BLV expresan más TNF-α y menos TNF-RI que las MACT.CONCLUSIONES: El BLV puede infectar células epiteliales mamarias bovinas in vitro. La infección de las células MAC-T genera un aumento en la expresión del ARNm de TNF-α y una disminución de la expresión del receptor TNF-RI. Esto coincide con lo observado en PBMC de animales infectados con BLV (Kabeya H, 2001) donde el aumento de TNF-α y la disminución de la expresión de TNF-RI (que contiene un dominio pro-apoptotico), favorecería la acción de la citoquina sobre el receptor tipo II (TNF-RII) y de esta manera aumentaría la proliferación celular. A partir de estos resultados sería interesante evaluar la capacidad de proliferación y el nivel de apoptosis de las células MACT infectadas con BLV.