Microorganismos del suelo y su participación en la formación de la materia orgánica: degradación de lignocelulosa.

SAPARRAT, M. C. N.,; BÁRCENA, ALEJANDRA; BALATTI, P. A.

Microbiología Agrícola Un aporte de la investigación en Argentina 2da edición

Magna

Lugar: Tucumán; Año: 2013; p. 65 - 92

Microorganismos del suelo y su participación en la formación de la materia orgánica: degradación de lignocelulosa. Soil microorganisms and their participation in the formation of organic matter: degradation of lignocellulose. Saparrat, Mario C. N.a,b,c,*, Alejandra Bárcenaa, Pedro A. Balattia,c,d a Instituto de Fisiología Vegetal (INFIVE), Universidad Nacional de La Plata (UNLP)- CCT-La Plata- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Diag. 113 y 61, CC 327, 1900-La Plata, Argentina b Instituto de Botánica Spegazzini, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, UNLP, 53 # 477, 1900-La Plata, Argentina c Cátedra de Microbiología Agrícola, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, UNLP, 60 y 119, 1900-La Plata, Argentina d Centro de Investigaciones de Fitopatología (CIDEFI), Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, UNLP, 60 y 119, 1900-La Plata, Argentina *E-mail: masaparrat@yahoo.com.ar;Tel.: +54 0221 4236618; fax: +54 0221 4233698. En el suelo coexisten diferentes procesos de transformación de la materia orgánica, los que incluyen reacciones de despolimerización, mineralización y síntesis de sustancias húmicas. Los polímeros estructurales de los residuos agrícolas y la hojarasca del mantillo forestal, como la celulosa y la lignina, son los aportes de carbono orgánico más importantes que llegan al suelo, que constituye un reservorio clave en el ciclo biogeoquímico del carbono. La transformación microbiana de celulosa y lignina en el suelo condiciona las características estructurales y químicas del mismo, lo que es crítico para la productividad del ecosistema, que se desarrolla a partir del subsistema suelo. Diferentes bacterias y hongos son los principales actores del proceso, en el que participan a través de diferentes estrategias de transformación y mecanismos. Asimismo, factores ambientales como la disponibilidad de oxígeno, pH y temperatura así como las características de los materiales lignocelulósicos son también parámetros claves de la transformación microbiana de estos polímeros. En este capítulo se analizará el rol de los microorganismos en la transformación de celulosa y lignina y como un caso de estudio se describe la participación de los hongos en la degradación de la hojarasca de Celtis ehrenbergiana y Scutia buxifolia, material que está asociado a un suelo forestal condicionado por el pH y su relación con la actividad enzimática lignocelulolítica. Además, se incluye información sobre las sustancias húmicas, precursores y su relación con la lignocelulosa en el contexto actualizado de los modelos de las sustancias húmicas y los procesos de transformación de la materia orgánica. Palabras clave: microorganismos, suelo, materia orgánica. 1. Introducción.- El carbono (C) y el oxígeno (O) son los componentes mayoritarios de la biomasa generada a través de los procesos de fotosíntesis (oxigénica y anoxigénica) y quimiolitotrofía que reducen el CO2 a carbono orgánico. En el marco del ciclo biogeoquímico del C (Figura 1), la transformación microbiológica del pool orgánico en el suelo involucra reacciones de mineralización y/o humificación. Guggenberger (2005) puntualizó a modo de recapitulación los procesos claves asociados con el ciclo de la materia orgánica en los suelos, distinguiendo los siguientes: deposición de hojarasca, transformación, descomposición, mineralización, partición -distribución-, asimilación y estabilización. Mientras que la mineralización es definida como la conversión microbiana de la materia orgánica en constituyentes inorgánicos, la humificación es el proceso en el que el carbono de los residuos orgánicos es transformado y convertido en sustancias húmicas a través de reacciones bioquímicas y abióticas (Guggenberger, 2005). La mineralización de la materia orgánica en el suelo es el resultado de diversos procesos que ocurren simultáneamente y que provocan la degradación entre otros de sustancias poliméricas, y la posterior fermentación (etanólica o alcohólica, ácido-mixta, butanodiólica, entre otras) y/o respiración (aeróbica y/o anaeróbica) de los monómeros liberados. Esto está en función de la presencia de microorganismos específicos que son responsables de cada proceso, lo que debe ser acompañado de condiciones predisponentes, como por ejemplo la disponibilidad de oxígeno, es decir que tanto los microorganismos como las condiciones están directamente relacionados con los ciclos de C y O. La humificación es el proceso de formación del humus, principal reservorio de C en el suelo; este convierte y acumula diferentes materiales orgánicos como humus. El humus se define como una estructura polifenólica, compleja, amorfa y recalcitrante que caracteriza el status nutricional de los suelos. El proceso y los mecanismos de síntesis así como la naturaleza de sus principales precursores se encuentra actualmente en análisis y discusión. A nivel cuantitativo la fracción más importante de carbono orgánico que ingresa al suelo son los residuos vegetales, ya sean en forma de rastrojos u hojarasca de sistemas forestales, material constituido por celulosa y lignina (Paul y Clark, 1996). Este es el material estructural de las paredes celulares de las plantas, esta matriz compleja corresponde a los siguientes polímeros: celulosa que forma parte de la estructura de la pared celular vegetal, hemicelulosa y un polímero de naturaleza aromática, la lignina (Figura 2). Este último cumple un rol clave en la rigidez de las paredes de las células vegetales xilemáticas y es lo que da sostén y contribuye a la defensa frente ataques microbianos (Martínez et al., 2005). La transformación de estos polímeros en el suelo es un proceso clave del ciclo biogeoquímico de carbono lo que tiene impacto en las características estructurales y químicas del suelo. Los microorganismos heterótrofos de la microbiota del suelo utilizan la lignocelulosa como sustrato de crecimiento y/o simplemente la degradan en reacciones cometabólicas, y de esta manera actúan sobre el flujo de energía en el sistema, lo que afecta a otros niveles tróficos y conduce además a la liberación de CO2 a la atmósfera. A causa del significado funcional que tiene la celulosa y la lignina como material de partida en los procesos de transformación de residuos vegetales en el suelo y en la formación de sustancias húmicas así como la estabilización de los suelos (Paul, 2007), en este capítulo se analizará el rol de los microorganismos en la transformación de ambos polímeros y como un caso de estudio se describe la participación de los hongos en la degradación de la hojarasca de Celtis ehrenbergiana y Scutia buxifolia, material que está asociado a un suelo forestal condicionado por el pH y su relación con la actividad enzimática lignocelulolítica. Además, se incluye información sobre las sustancias húmicas, precursores y su relación con la lignocelulosa en el contexto actualizado de los modelos de las sustancias húmicas y los procesos de transformación de la materia orgánica. 2. Lignocelulosa y su degradación en el suelo.- La lignocelulosa es el componente clave de la matriz estructural de las paredes celulares de las plantas. La celulosa, que habitualmente representa entre el 35 y el 50 % de la masa seca de la biomasa vegetal, es un polímero linear de celobiosa (D-glucopiranosil-β-1,4-D-glucopiranosa; Figura 3). La celulosa forma en la pared agregados de cadenas, que están estabilizadas por puentes de hidrógeno intra- e intermoleculares; a estos se los conoce como microfibrillas que tienen unos pocos nanómetros de diámetro. La celulosa en la pared presenta un estado semicristalino en el que se identifican sectores ordenados y amorfos, estos últimos más susceptibles a lo hidrólisis enzimática (Lynd et al., 2002; Thomas et al., 2012). Las microfibrillas suelen agregarse en estructuras mayores definidas como macrofibrillas y estas últimas en paquetes que se asocian con los otros polímeros de la pared. La hemicelulosa corresponde a otros polisacáridos que forman la pared, y si bien estos están formados principalmente por xilanos y mananos, pueden contener otros constituyentes. La hemicelulosa está estrechamente asociada con las microfibrillas de celulosa y conforma un complejo con la lignina a través de enlaces covalentes y puentes de hidrógeno (Núñez, 2004). Uno de los principales componentes de la hemicelulosa en las células xilemáticas de maderas duras es el xilano, que representa entre el 15 y el 30% de la masa seca. Este es un polisacárido de unidades de D-xilosa unidas por enlaces de tipo b-1,4, pudiendo incluso estar sustituidos con otros monosacáridos. La hemicelulosa de maderas blandas contiene principalmente galactoglucomananos, en cantidades que van del 15-20% de la masa seca. Este es un polisacárido compuesto de D-glucosa y D-galactosa unidas también por enlaces tipo b-1,4 (Bugg et al., 2011). La lignina representa entre el 20 y el 30 % de la masa seca y es un polímero tridimensional de hasta 3 unidades fenilpropanoides, no metoxiladas (p-hidroxifenílica, H), mono- (guaiacílica, G) o di-metoxiladas (siringílica, S), derivadas de alcoholes p-hidroxicinamílicos, que dan origen a una variedad de subunidades incluyendo diferentes enlaces C-C y éter (Martínez et al., 2005). La estructura de la lignina no se conoce con exactitud y hasta el momento tan sólo se han descripto modelos estructurales que se han ido mejorando gracias al avance de las técnicas analíticas. Entre estas, la Resonancia Magnética Nuclear Bidimensional (2D-NMR), ha permitido el reciente descubrimiento de nuevas subestructuras (Rencoret, 2008; Figura 4). La composición de la lignina en términos de la relación entre las unidades H:G:S varía entre los diferentes grupos de plantas vasculares. Las gimnospermas leñosas (coníferas) tienen el contenido más alto de lignina, la cual se compone principalmente de unidades G. En el otro extremo, la lignina de las angiospermas leñosas (caracterizadas por sus maderas duras) consiste en mayor medida de unidades G y S, y la lignina de angiospermas herbáceas contiene también unidades H. También la composición de la lignina varía según los diferentes tejidos de la madera y las capas de la pared celular (por ejemplo, la lignina de la laminilla media generalmente tiene una menor relación S/G que aquella de la pared secundaria; Martínez et al., 2005). La lignina es un constituyente clave de la pared celular que le da rigidez a la planta, aportándole además resistencia a la degradación microbiana. La lignina y los compuestos de baja masa molecular de la fracción extraíble determinan el color pardo amarillento de los restos lignocelulósicos. Este color es el resultado de un efecto óptico de la serie de dobles enlaces del anillo bencénico presentes en su estructura. Los enlaces éter y C-C de la lignina no son susceptibles al ataque hidrolítico, por ello la lignina es altamente resistente a la despolimerización. Incluso, las microfibrillas de celulosa se revisten con la lignina de manera de generar una barrera física a la degradación de polisacáridos. A diferencia de las hemicelulosas, las pectinas y otros polímeros menores mixtos de azúcares, que son altamente susceptibles como fuente de carbono y energía por un amplio espectro de microorganismos no específicos considerados como R-estrategas, la celulosa y la lignina son recalcitrantes a la degradación, es decir que son degradados más lentamente, lo que se debe en parte a la acción de microorganismos específicos considerados K-estrategas (Sylvia et al., 2005). La descomposición microbiológica de celulosa en el suelo no solo contribuye al flujo de energía en los suelos y al reciclado de C, sino que además afecta la movilización de otros nutrientes como N, P y S. La celulólisis consiste en una serie de procesos mediados por enzimas de microorganismos que utilizan la celulosa como fuente de carbono y energía (asimilación) que incluye: 1. un evento inicial de acondicionamiento que consiste en la desorganización de sectores cristalinos; 2. otro de despolimerización extracelular que genera pooles de oligosacáridos hasta celobiosa o incluso glucosa; y 3. un último evento en el que se produce la hidrólisis de la glucosa. La desorganización de la estructura lignocelulósica es clave para exponer la celulosa al ataque enzimático y aumentar el área susceptible a la despolimerización. No obstante, algunos microorganismos, como los hongos causantes de pudrición parda de la madera, degradan en células (vegetales) intactas la celulosa de la capa S2 de la pared celular a través de un sistema no enzimático involucrando especies reactivas de oxígeno (Steenkjær Hastrup et al., 2011). En la despolimerización enzimática de la celulosa actúan tres grupos de enzimas: 1. endoglucanasas, endo 1,4-b-D-glucano-4-glucanohidrolasas, que catalizan en forma aleatoria la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la cadena de celulosa; 2. exoglucanasas, celobiohidrolasas (exo 1,4-b-D-glucano-4-celobiohidrolasas), que liberan celobiosa o glucosa desde el extremo no-reductor de la celulosa; y 3. β-glucosidasas, también conocidas como celobiasas que hidrolizan celobiosa y otras celodextrinas solubles a glucosa (Singh y Hayashi, 1995). Estas enzimas pueden ser secretadas fuera de las células microbianas o pueden permanecer inmovilizadas en estructuras globulares sobre la superficie microbiana constituyendo el celulosoma. Este sistema se encuentra principalmente en organismos anaeróbicos en los que de esta manera se incrementa la eficiencia de la celulólisis (Lynd et al., 2002). La mayor actividad celulolítica se observó en reacciones conteniendo mezclas de enzimas del sistema celulolítico que actúan sinérgicamente (Wood et al., 1989), lo que es probable que ocurra en el suelo (Zhou y Ingram, 2000). Existe una diversidad de microorganismos de suelo y asociados al material vegetal como rastrojos agrícolas y hojarasca del mantillo del suelo forestal, que incluyen bacterias aeróbicas y anaeróbicas y hongos, que participan en la degradación de la celulosa. Estos microorganismos sintetizan diferentes enzimas que componen sistemas enzimáticos especificos según de cada microorganismo. Estas enzimas difieren en las propiedades catalíticas, ya que muchas son isoenzimas en su respuesta al pH, fuerza iónica y tipo de sustrato lignocelulósico, incluyendo la relación C/N y tenor de lignina (Lynd et al., 2002). La mayor actividad celulolítica se da en ambientes aeróbicos, y solo un 5-10 % de la degradación se lleva a cabo bajo condiciones anaeróbicas (Coughlan y Mayer, 1992). Mientras que bacterias celulolíticas aeróbicas incluyen a representantes de los géneros Cellulomonas, Cellovibrio, Cytophaga y Thermomonospora así como del género Streptomyces (phylum Actinobacteria), entre las anaeróbicas están las representadas por Acetovibrio, Bacteroides, Clostridium (phylum Firmicutes) y Ruminococcus. Entre los hongos celulolíticos, se incluyen unos de los phyla Ascomycota (los géneros Chaetomiun y Trichoderma se encuentran entre los más estudiados, a tal punto que se han caracterizado sus enzimas celulolíticas a nivel transcripcional y proteómico), Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (sólo ciertos miembros del género Mucor presentan significativa actividad celulolítica; Cooke y Whipps, 1993). Se han descripto también hongos anaeróbicos celulolíticos, incluidos en el phylum Neocallimastigomycota, que están asociados a la microflora del sistema digestivo de animales rumiantes. Diferentes microorganismos eucariotas pertenecientes al phylum Oomycota (Reino Straminipila) también degradan la celulosa. A pesar de los numerosos estudios sobre la degradación microbiana de lignocelulosa, existen escasos datos sobre Archaea capaces de atacar celulosa cristalina, destacándose unas hipertermófilas afines a Ignisphaera aggregans, Pyrobaculum islandicum y Thermofilum pendues (Gram et al., 2011). No obstante, es difícil imaginar el rol de estos microorganismos considerando que las condiciones extremas en las que desarrollan probablemente no tenga relación estrecha con el crecimiento de plantas vasculares y el aporte al suelo de lignocelulosa. La degradación de la lignina ha sido estudiada con mayor énfasis en representantes del phylum Basidiomycota que son los que más frecuentemente están asociados a maderas, en los que se han descripto un número de enzimas oxidativas (lacasa, LiP, MnP , VP) y mecanismos de ataque de la lignina (Martínez et al., 2005; Jurado et al., 2011). Los hongos causantes de pudrición blanca de la madera son degradadores agresivos debido a su capacidad para degradar lignina, hemicelulosa y celulosa, a menudo generando un material blanco enriquecido en celulosa. Otros hongos asociados al ataque de la madera son los causantes de la pudrición parda que desarrollan sobre maderas blandas y representan sólo el 7 % de los basidiomycetes degradadores de madera. Aunque ellos también pueden degradar polisacáridos de la madera, solo modifican parcialmente la lignina, la cual torna a un color pardo (lignina oxidada), que es una fuente potencial de compuestos aromáticos para la fracción estable de la materia orgánica de los suelos forestales (sustancias húmicas). Un tercer grupo de hongos que atacan madera son los hongos causantes de pudriciones blandas, son representantes del phylum Ascomycota que hidrolizan sólo los polisacaridos accesibles pero no poseen sistemas enzimáticos que alteren la estructura de la madera atacada. Este último tipo de pudrición con frecuencia ocurre bajo un ambiente de elevada humedad relativa. Muchos trabajos reportan los mecanismos involucrados en la degradación de lignina por hongos causantes de pudrición blanca de la madera, las enzimas que intervienen, y las condiciones que favorecen el proceso (Martínez et al., 2005). Aunque las reacciones de las enzimas ligninolíticas con compuestos modelos de lignina están bien caracterizadas, no está claro si estas enzimas puedan oxidar la lignina polimérica nativa. Esto sugiere que otras reacciones podrían estar también involucradas en el estado inicial de la despolimerización de lignina. En contraste con los hongos causantes de pudrición blanca, que sintetizan un arsenal de enzimas oxidativas extracelulares que despolimerizan lignina, los hongos causantes de la pudrición parda solo hidrolizan la celulosa. La descomposición de lignina se ha estudiado principalmente en hongos del phylum Basidiomycota causantes de pudriciones blancas sobre madera de árboles en pie, pero existen estudios que demuestran el potencial de otros hongos y bacterias de suelo y que viven en la hojarasca o mantillo del bosque que metabolizan la lignina (Perestelo et al., 1999; Saparrat et al., 2002: Tabla 1). En suelos de bosques en el horizonte superficial A, la hojarasca se encuentra en contacto directo y asociada a hongos saprótrofos del Phylum Basidiomycota productores de enzimas oxidativas, como los hongos causantes de pudrición blanca, que contribuyen con la degradación de lignina en el suelo forestal (Baldrian, 2008). No obstante, la actividad ligninolítica de estos hongos de Basidiomycota descomponedores de hojarasca es moderada comparada con la eficiencia ligninolítica de los hongos causantes de pudrición blanca sobre madera (Steffen, 2003). Asimismo, se ha comprobado que hongos del phylum Ascomycota y sus anamorfos también poseen la habilidad para degradar lignina, aunque en menor grado que los hongos de la pudrición blanca, ya sea como fuente de C (asimilación) como bajo condiciones de cometabolismo (Rodríguez et al., 1994; Bi et al., 2012). La asimilación de carbono consiste en incorporarlo a la biomasa microbiana (Guggenberger, 2005), el cometabolismo es definido como la transformación de un compuesto llamado co-sustrato en presencia de un sustrato asimilable (García Rivero y Peralta-Pérez, 2008). Mientras que la celulosa es una fuente de carbono y energía asimilada por los microorganismos, la degradación de lignina provocada por hongos de la pudrición blanca es considerada un proceso cometabólico. Sin embargo, en numerosos estudios se ha demostrado la habilidad de diferentes bacterias y hongos (no basidiomicetaceos) de utilizar lignina como fuente de carbono y energía, si bien la ineficiencia del proceso hace que el incremento de biomasa de estos microorganismos sea reducido (Saparrat et al., 2002). Basado en el modelo de Berg y Staaf (1980), la degradación de lignina en la hojarasca sólo es importante en un estado avanzado de descomposición (cuando no hay disponibilidad de sustratos carbonados fácilmente asimilables) comparado a la etapa inicial de degradación de la hojarasca en el suelo donde la pérdida de masa es controlada por compuestos solubles y celulosa expuesta. No obstante, Klotzbucher et al. (2011) recientemente reportaron que la degradación de lignina de diferentes hojarascas en los suelos depende fuertemente del aporte continuo de fuentes de carbono y energía fácilmente disponibles, los cuales son clave en la ligninólisis. Por lo tanto, adicionales estudios son necesarios para concluir bajo qué situaciones los microorganismos del suelo utilizan lignina y si esto tiene significancia en el porcentaje de materia orgánica mineralizada. Aunque la degradación de lignina por bacterias y hongos anamorfos es limitada, su contribución podría ser importante debido a la abundancia que estos microorganismos tienen en los suelos y la hojarasca asociada (Kirk y Farrell, 1987), probablemente a través de la actividad de consorcios microbianos (Steffen, 2003). Se ha descripto la existencia de bacterias del suelo que metabolizan lignina; la mayoría correspondientes al grupo de Actinobacteria, α-Proteobacteria y γ-Proteobacteria (Bugg et al., 2011; Taylor et al., 2012). Estos grupos bacterianos suelen estar presentes en los sistemas digestivos de termites e insectos que infectan (atacan) madera. Estas bacterias despolimerizan lignina Kraft de alta y baja masa molecular, y producen a partir de lignocelulosa de trigo metabolitos de la ruta catabólica de compuestos aromáticos como el ácido oxálico y el ácido protocatéquico. La actividad ligninolítica de algunas bacterias fue mayor en presencia de peróxido de hidrógeno, por lo que se ha asociado a las peroxidasas extracelulares con el proceso, si bien otras bacterias atacan lignina sin agregar peróxido de hidrógeno, lo que sugiere la produccion de peróxido de hidrógeno in-situ y/o la presencia de sistemas enzimáticos tipo lacasa (Taylor et al., 2012). Las evidencias que sustentan la habilidad bacteriana para metabolizar lignina son: 1. el crecimiento de los aislamientos sobre medios minimos conteniendo lignina Kraft fraccionada por tamaño como única fuente de carbono; 2. la despolimerizacion de lignina Kraft de alta masa molecular y la generación consecuente de productos de baja masa molecular; 3. la detección de metabolitos específicos de baja masa molecular, cuyas estructuras son consistentes con rutas de degradacion de fragmentos modelos de lignina; y 4. la actividad de degradacion usando diferentes preparaciones de lignina, tal como la lignina nitratada y lignina Kraft. Si bien ciertas enzimas de bacterias que degradan lignina han sido identificadas y caracterizadas con sustratos modelos, resta conocer cuales son los procesos/mecanismos de la degradación bacteriana de la lignina y sus fragmentos oxidados. Además se deben identificar con precisión los pasos de las vías catabólicas involucradas, ya que el conocimiento actual sólo es inferido a partir de los datos obtenidos en experimentos con compuestos modelo de la lignina que son simples (no poliméricos) y que presentan unicamente un enlace representativo (Taylor et al., 2012). 3. Degradación in-vitro de hojarasca de Celtis ehrenbergiana y Scutia buxifolia por anamorfos de Ascomycota: rol de los sistemas enzimáticos lignocelulolíticos.- La hojarasca de los bosques es muchas veces considerada un componente del estrato F en suelos forestales y es uno de los principales aportes de lignocelulosa y C microbiano al suelo de esos ambientes (Kandeler et al., 2005). Entre los microorganismos del suelo, los hongos cumplen un rol clave en la descomposición y mineralización de la materia orgánica animal y vegetal, y por ello son responsables de la fertilidad del suelo (Pfenning y Magalhães de Abreu, 2008). Ellos constituyen el 75 % a 95 % del total de la biomasa microbiana y transforman la hojarasca, rol que es más relevante que el de las bacterias, probablemente debido a que el desarrollo miceliar permite explorar una mayor superficie (Kjoller y Struve, 1982; Gaspar et al., 2001; Busso et al., 2008). Además, los hongos interactúan en forma directa o indirecta con otros organismos, favoreciendo el desarrollo, la estabilidad y el control de los ecosistemas, incluido el suelo y sus comunidades vegetales asociadas (Trape y Luoma, 1992). Los ?talares? son bosques nativos dominados por Celtis ehrenbergiana (Klotzsch) Liebm. (Celtidaceae) y Scutia buxifolia Reissek (Rhamnaceae) del Noreste de la Provincia de Buenos Aires (Argentina, Arturi, 1997). Estos representan la principal comunidad boscosa nativa de la Región, cuya fisonomía responde a las propiedades de sus suelos tipo Rendol (alcalino-calcáreos, Arturi, 1997). Entre estas, en esta comunidad el pH del suelo puede alcanzar valores cercanos a 9, y por ello es un regulador de la actividad microbiana (Elíades et al., 2010, 2011a,b; Saparrat et al., 2007, 2008, 2010). La hojarasca de C. ehrenbergiana y S. buxifolia en estos bosques es el reservorio de nutrientes, incluyendo al C, así como también de un amplio espectro de hongos saprótrofos (Allegrucci et al., 2005, 2007). Numerosos trabajos han reportado recientemente sobre el estado del arte de las comunidades de hongos asociados a los suelos y su hojarasca de los talares de Magdalena, así como su contribución a la transformación de la materia organica (Allegrucci et al., 2003, 2009; Cabello y Arambarri, 2002; Crous et al., 2005; Elíades et al., 2004, 2006, 2011a,b). Por ello, se ha estudiado la degradación in-vitro de la hojarasca de ambas especies vegetales por hongos anamorfos de Ascomycota y el rol de sus sistemas enzimáticos lignocelulolíticos. Entre los resultados obtenidos, se identificaron propiedades fisico-químicas de la hojarasca y actividades enzimáticas como herramientas diagnósticas de la degradación fungica (Saparrat et al., 2008). Mientras que el pH, los azúcares reductores y los cromóforos revelaron ser parámetros indicadores confiables de la descomposición de la hojarasca de C. ehrenbergiana y S. buxifolia, la degradación de la hojarasca de S. buxifolia sólo se relacionó con los componentes enzimáticos celulolíticos: celobiohidrolasa y β-1,4 endoglucanasa (Figura 5a,b). Sólo la actividad β-glucosidasa, tercer componente del sistema celulolítico fúngico, estuvo asociada a la degradación de la hojarasca de C. ehrenbergiana (Figura 5c; Saparrat et al., 2008). Con respecto al componente ligninolítico, la actividad enzimática oxidativa no se relacionó con el proceso de degradación (Figura 5d). Se caracterizó también el potencial celulolítico de Ulocladium botrytis LPSC 813, un hongo aislado a partir de la hojarasca de S. buxifolia, que produjo enzimas con actividad β-1,4 endoglucanasa que están involucradas con el proceso de degradación (Saparrat et al., 2007). Ciliochorella buxifolia (anamorfo de Ascomycota, Allegrucci et al., 2011), es un hongo frecuente en la hojarasca de S. buxifolia (Allegrucci et al., 2005). El crecimiento de este hongo redujo la masa de la hojarasca en un 4,7 % a los 60 días de incubación, lo que fue acompañado de una disminución relativa en la intensidad de las bandas espectrales FTIR (espectroscopía infrarroja con transformación de Fourier) asociadas a polímeros de la pared celular del sustrato como polisacáridos, lignina y proteínas. Paralelamente en las fracciones solubles asociadas a la hojarasca transformada por el hongo se observaron variaciones en los niveles de amonio, azúcares reductores y pH respecto a aquellas correspondientes a las muestras control sin inocular. Además se observaron incrementos en los niveles de β-1,4 endoglucanasa acorde con la extensión de la degradación del sustrato, si bien no se detectó actividad oxidativa extracelular en el sustrato transformado por el hongo. Los resultados sugieren una estrecha relación entre la capacidad del hongo para metabolizar estos sustratos y su posible rol como colonizador primario en la hojarasca de S. buxifolia (resultados inéditos y parciales en Troncozo et al., 2008 y Saparrat et al., 2010). Adicionalmente, y en base a que C. buxifolia aislamiento LPSC # 847 reveló actividad oxidativa extracelular sobre cultivos agarizados suplementados con guaiacol y otros compuestos fenólicos, se observaron incrementos significativos en los niveles de la actividad lacasa (resultados inéditos y parciales en Troncozo et al., 2011). Además se analizó la capacidad de hongos aislados de los suelos alcalino-calcáreos y neutros de los bosques de C. ehrenbergiana y S. buxifolia así como de hongos asociados a los suelos alcalino-sódicos cubiertos de Distichlis spicata en el este de la provincia de Buenos Aires (Reserva Biosfera ??Parque Costero del Sur??, Argentina) para crecer y producir actividades del complejo celulolítico (actividad endo-glucanasa y β-glucosidasa) sobre cultivos a pH 6,0 y 9,0 (Elíades et al., 2010, 2011a,b). Se observó que la actividad de estos hongos y el pH del medio donde desarrollan están estrechamente relacionados. Estos resultados sugieren que estos hongos tienen mecanismos (aún desconocidos) que les permiten tolerar pH alcalinos. Puesto que las enzimas sintetizadas por estos hongos tienen potencial de aplicación en diferentes desarrollos tecnológicos (Elíades et al., 2011a,b; Jurado et al., 2011), futuros estudios revelarán información sobre sus propiedades catalíticas y su factibilidad como herramientas biotecnológicas. 4. Sustancias húmicas: precursores, su relación con la lignocelulosa y procesos de estabilización de la materia orgánica.- La materia orgánica del suelo representa un continuum que abarca desde residuos alterados amorfos de la biota, en proceso de descomposición, exudados radiculares, biomasa microbiana, biomoléculas como sustancias no húmicas y sustancias húmicas. Convencionalmente, acorde al concepto clásico de la teoría del polímero, se acepta que la materia orgánica del suelo consiste predominantemente de sustancias húmicas (humus, 60-70 % de la materia orgánica del suelo), las que son sintetizadas en un proceso llamado ?humificación? del material orgánico. Las sustancias no húmicas son compuestos orgánicos de estructura definida como proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, y pequeñas moléculas tales como azúcares y aminoácidos, siendo la mayoría de ellos fácilmente degradables y pueden ser utilizados como sustrato por microorganismos del suelo, de tal forma que su existencia es transitoria. Las sustancias húmicas son los constituyentes más activos de la materia orgánica del suelo en términos de sus funciones ambientales y agroecológicas (Almendros, 2008a,b). Las sustancias húmicas afectan las propiedades físicas y químicas del suelo y aumentan la fertilidad del mismo, porque intervienen en varios ciclos biogeoquímicos que ocurren en el suelo. El efecto indirecto de las sustancias húmicas sobre el crecimiento de las plantas consiste en el acomplejamiento de cationes y en el aumento de la biodisponibilidad a las plantas. Las sustancias húmicas forman complejos sistemas húmico-metal que alteran la absorción de nutrientes por la planta (García-Mina, 2000). Por otro lado, las sustancias húmicas interactúan con procesos metabólicos relacionados con el crecimiento de la planta como la respiración y la síntesis proteica; así como por su actividad hormonal a través de la inhibición de la actividad de la enzima ácido indol-acético (AIA)-oxidasa, por lo que contribuirían a elevar los contenidos de ácido indol-acético en los tejidos y por lo tanto, estimular el crecimiento vegetal (Sánchez, 1999; Pizzeghello et al., 2002). Otro elemento distintivo de las sustancias húmicas es su actividad catalítica en las reacciones de hidrólisis y condensación (Klavins et al., 2001). Las sustancias húmicas representan una clase de polímeros de alta masa molecular de color amarillo a pardo oscuro o negro. Tienen un núcleo de tipo aromático y un grupo de componentes alifáticos enriquecidos con nitrógeno heterocíclico, que es estable bajo condiciones naturales. Estos componentes del humus, son químicamente indefinidos, siendo refractarios, complejos, heterogéneos, amorfos y polidispersos, Estos se caracterizan por presentar variada masa molecular, multitud de grupos funcionales, presencia de grupos oxigenados (carboxílicos, OH fenólicos y enólicos, OH alcohólicos, y C=O de quinonas), alto contenido de grupos ácidos (carboxílicos y fenólicos, principalmente) que le otorgan propiedades reguladoras del pH. Las sustancias húmicas tienen un mayor contenido de C y menor de O que la mayoría de sus precursores. Su composición elemental se puede sintetizar en: C, 45-55 %; H, 3-6 %; N, 1-5 %; O, 30-45 %; S, 0-1%. Además las sustancias húmicas están estrechamente asociados con los constituyentes inorgánicos de los suelos, a menudo formando agregados, lo cual explica su lenta modificación y/o mineralización. Todas estas características explican su resistencia a la degradación y al ataque químico. No obstante, las sustancias húmicas son definidas convencionalmente en tres categorías: ácidos húmicos (AH, fracción soluble en medio alcalino e insoluble en medio ácido), ácidos fúlvicos (AF, fracción soluble tanto en medio alcalino como en medio ácido), y humina (material orgánica insoluble en los residuos alcalinos). La humificación es entendida como la serie de procesos por los cuales el carbono de las sustancias orgánicas precursoras son transformadas y convertidas en sustancias húmicas a través de procesos bioquímicos y abióticos (Figura 6). La lignina y sus productos de transformación así como también polisacáridos, melanina, cutina, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, partículas finas de carbón, entre otros, son componentes importantes que participan del proceso. Se han propuesto dos principales mecanismos del proceso de humificación, que pueden estar interrelacionados, no ser exclusivos, e incluso ser convergentes (Almendros, 2008b): 1. uno que implica la alteración del material macromolecular preexistente sin previa degradación; y 2. otro que consiste en la condensación de precursores de baja masa molecular provenientes de la degradación de biomacromoléculas o de la síntesis biológica. Dentro de los mecanismos de estabilización se pueden incluso distinguir dos subtipos: 1.1. Alteración estructural progresiva de biomacromoléculas recalcitrantes como lignina y biopoliésteres como cutinas y suberinas, o de origen microbiano como los botriococanos, seguido de una reorganización estructural que es inducida por los microorganismos, a lo que se conoce como reutilización microbiana, con la posterior incorporación de productos conteniendo N y estructuras álcalis de origen microbiano. Estas alteraciones prevalecen en suelos con una actividad biológica baja y media y están relacionadas a los niveles de oxígeno molecular en el ambiente. 1.2. Alteración de formas biosintéticas microbianas análogas a sustancias húmicas como son las melaninas fúngicas que actúan como fuente de materia orgánica, las que además son también resistentes a la biodegradación. Diferentes reacciones pueden también incluso diferenciarse en los procesos de condensación: 2.1. Reacciones bioorgánicas a través de la biodegradación y condensación en estructuras macromoleculares, como es el caso de la condensación enzimática de compuestos generados durante la degradación de lignina y otros biopolímeros, que incluye también la condensación de lixiviados y/o exudados de estructuras vegetales (hojas y raíces) que además son favorecidos por la matriz de las enzimas del suelo. 2.2. Reacciones de síntesis abióticas a partir de precursores aromáticos (fenoles) o alifáticos simples, que condensan con aminoácidos, formando productos de alta masa molecular de color marrón del tipo catecol-glicina. 2.3. Síntesis de análogos de productos de Maillard vía la condensación de aminoácidos y carbohidratos, como resultado de lo cual se forman macromoléculas heterogéneas. Este proceso ocurre en suelos y/o sedimentos en donde la materia orgánica no se biodegrada rápidamente debido a bajas temperaturas, anegaciones (falta de oxígeno molecular), oligotrofia o presencia de productos antimicrobianos. También se forman abióticamente a través de la deshidratación de carbohidratos en medios pobres en nitrógeno (pseudomelanoidinas). Además en situaciones extremas, como son los suelos afectados por incendios, procesos abióticos conducen a una serie de partículas orgánicas carbonizadas progresivas que finalmente forman el llamado ?carbón negro? (Guggenberger, 2005). 2.4. Otras reacciones consisten en la condensación abiótica de lípidos (ácidos grasos) insaturados que forman productos de alta masa molecular. Estas reacciones involucran unas de foto-oxidación, donde la presencia de óxidos, arcillas y otros catalizadores inorgánicos puede incrementar el envejecimiento fotoquímico y la resinificación de lípidos y su asociación a sustancias húmicas preexistentes, pudiendo incluso desarrollarse en suelos donde la actividad biológica está limitada por la falta de agua (Almendros, 2008b). Todo esto sugiere que las sustancias húmicas tienen un origen complejo y una estructura macromolecular heterogénea que además es una función de los materiales de origen y las condiciones ambientales de los distintos suelos (Stevenson, 1982), siendo de importancia capital en la comprensión de la composición, características, actividad y calidad del suelo y su fertilidad así como en el estudio de los mecanismos de secuestro de C en el suelo. Diferentes metodologías rigurosas y estandarizadas se han utilizado para la caracterización de la humificación y las sustancias húmicas en el marco de la teoría del polímero o modelo polimérico de estas sustancias. Entre éstas se pueden incluir: ultracentrifugación, extracción en solución alcalina, identificación de estructuras químicas y su relación con posibles precursores del C y O del humus en base a mediciones del 13C y del 18O a través de estudios de espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) y pirólisis-cromatografía gaseosa (Paul y Clark, 1996). No obstante la aplicación y el desarrollo de nuevos procedimientos y técnicas no resultan del todo consistentes con este modelo (Orsetti, 2010). Todo esto condujo a un nuevo concepto de las sustancias húmicas como una asociación supramolecular de un grupo relativamente pequeño de moléculas heterogéneas que se ensamblan en si mismas por fuerzas débiles a valores de pH neutros (Piccolo, 2000). Entre las técnicas empleadas que evidencian este segundo modelo se pueden mencionar: algunas de tipo no destructivas tales como unas técnicas espectroscópicas transformadas, unas destructivas como de pirólisis, de ionización suave, y también cromatográficas como la cromatografía de permeación en gel y cromatografía de exclusión por tamaño de alta presión, cuya sigla en inglés es HPSEC, así como electroforesis de capilar de alta resolución (HPCE). Entre los aportes logrados, la HPSEC reveló que el tamaño aparente de fragmentos húmicos cambia drásticamente con la adición de ácidos orgánicos simples comparado con lo observado cuando se adiciona HCl como referencia. Además la HPCE separó algunos tipos de compuestos suficientemente solubles en soluciones buffer acuosas, ofreciendo la posibilidad de distinguir en las sustancias húmicas entre compuestos de alta y baja masa molar. En resumen, este segundo modelo considera a las sustancias húmicas como una supermolécula, correspondiendo a un próximo nivel de complejidad de la materia después de las partículas elementales, el núcleo, el átomo y la molécula (Valdés Carmenate y Balbín Arias, 2002). Sobre la base de esta teoría, las sustancias húmicas son agregados (asociaciones) supramoleculares compuestos de diferentes números de monómeros (moléculas relativamente pequeñas y químicamente diversas) individuales de origen microbiano y vegetal con relativamente baja masa molecular, los cuales están asociados y forman un agregado (cluster) unido por interacciones no covalentes tipo hidrofóbicas (aromáticas), de van der Waals, electrostáticas y puentes de hidrógeno. La organización supramolecular de los sustancias húmicas explica más fielmente sus parámetros tales como polidispersión, heterogeneidad, anfifilicidad, dinamicidad y su habilidad de renovación. La similitud de las sustancias húmicas está principalmente relacionada a los grupos similares de precursores en todos los ambientes, y sus distinciones son debido a las diferencias de los componentes y sus combinaciones aleatorias. Por analogía con otros sistemas macromoleculares, tres niveles estructurales pueden ser diferenciados en sistemas húmicos (García-Mina, 2000): 1. Estructura primaria: correspondiente al orden lineal de los átomos y grupos funcionales diferentes en las moléculas; 2. Estructura secundaria: correspondiente a la configuración molecular resultante de interacciones intramoleculares; y 3. Estructura terciaria: correspondiente a la configuración molecular asociada con interacciones intermoleculares. Bajo ciertas condiciones experimentales, es también posible hablar de una estructura cuaternaria correspondiente a los agregados macromoleculares. La habilidad para formar complejos, es decir, la formación de centros formadores de complejos con funcionalidad viable, está directamente relacionada con las estructuras 2ria y 3ria del sistema húmico, lo que está también influenciado por los cambios conformacionales asociados con las variaciones en ciertas condiciones experimentales tales como pH, fuerza iónica, temperatura y concentración. Sin embargo, adicional información utilizando diferentes técnicas de avanzada (Semenov et al., 2013) sugiere que tanto el modelo polimérico y el de la asociación supramolecular explican complementariamente la naturaleza y características de las sustancias húmicas y sus propiedades en el suelo (y en otros ambientes naturales). En este sentido, las sustancias húmicas se definen como formas de polímeros macromoleculares y monómeros organizados supramolecularmente, que presentan algunas propiedades de supraestructuras y que están asociados en agregados, los que a la vez pueden unirse a través de enlaces covalentes entre monómeros de supramoléculas (Semenov et al., 2013). Por lo tanto, y en base a este concepto dual, todas los biomoléculas, incluyendo aquellas consideradas previamente como sustancias no húmicas, que no pueden ser separadas sin significantes cambios en la estructura de la supramolécula y en las propiedades químicas de su fracción húmica, formarían parte de las sustancias húmicas (Semenov et al., 2013). Esto sugiere la utilización del término de estabilización de la materia orgánica en reemplazo al término de humificación, siendo definido como un proceso de tres etapas, el cual incluye la degradación de la materia orgánica original, la agregación de los productos de degradación y la descomposición de los productos de agregación. Además la estabilización de la materia orgánica, que implica procesos que incrementan su resistencia en el suelo, es controlada por un rango más amplio de mecanismos físicos, químicos y biológicos comparados con la humificación. Futuros estudios contribuirán al avance del conocimiento de la génesis de la materia orgánica estabilizada en el suelo, los mecanismos involucrados y sus principales precursores, lo que acorde al constante desarrollo de técnicas y la optimización de procedimientos analíticos, definirá con mayor precisión la naturaleza de las ?sustancias húmicas? y sus propiedades. 5. Perspectivas futuras.- La lignocelulosa es uno de los componentes clave del carbono en el suelo y es una fuente de energía para un amplio espectro de microorganismos que la degradan y que de esta manera generan también estructuras precursoras de las sustancia húmicas a través de reacciones que estabilizan la meteria orgánica. Muchos trabajos asocian a la microbiota lignocelulolítica a diferentes tipos de sustratos orgánicos en diversos ecosistemas, las enzimas que intervienen y las condiciones que favorecen la degradación de celulosa y lignina. Los trabajos con la micobiota asociada a los hojarasca de los bosques de Celtis ehrenbergiana y Scutia buxifolia del Noreste de la Provincia de Buenos Aires (Argentina) mostraron que hay una relación estrecha entre los componentes enzimáticos del sistema celulolítico y además que la degradación depende del pH del suelo y del tipo de sustrato carbonado. No obstante, aún resta identificar los mecanismos de los hongos que toleran pHs alcalinos como los de los suelos donde se acumula la hojarasca. Además es importante conocer si las características catalíticas de las enzimas son compatibles con el ambiente donde se liberan y actuán. Estos estudios son particularmente importantes debido a que estas enzimas actúan a pH alcalino, lo que sugiere que estos organismos podrían cumplir roles en la transformación de la materia orgánica pero además ser herramientas tecnológicas clave. Si bien la degradación de la lignina llevada a cabo por bacterias y hongos no basidiomicetaceos en el suelo es de baja intensidad, nuevos estudios brindarán información clave sobre los aspectos básicos del proceso, que aún hoy están en discusión. Por otro lado, esto revelará cuál es el rol de estos microorganismos en el suelo y de que manera se relacionan con la génesis de fragmentos aromáticos de bajo peso molecular que además suministran como precursores la síntesis de sustancias húmicas. Acorde con la tendencia a un nuevo concepto sobre el origen de la materia orgánica del suelo, y su estabilidad, la identificación de parámetros estructurales y funcionales de las sustancias húmicas y la aplicación de modelos de consenso para explicarlo dependen de las metodologías y las técnicas de estudio. El esclarecimiento de los mecanismos y vías de síntesis de las sustancias húmicas estará en función del conocimiento de las características de estas sustancias, lo que está limitado a su vez por la complejidad y heterogeneidad de las sustancias húmicas. La falta de una técnica experimental que genere por si sola una imagen clara de la estructura de las sustancias húmicas, el uso de métodos complementarios proporcionará un conocimiento más preciso. La identificación de los principales procesos de la síntesis de las sustancias húmicas y de las condiciones de génesis, incluyendo el rol de los microorganismos y los productos que se generan como resultado de la transformación de la lignocelulosa, dará un papel diagnóstico del funcionamiento del suelo y su impacto en la producción vegetal asociada, lo que es fundamental al estudiar los sistemas afectados por la actividad humana. 6. Agradecimientos.- M. C. N. Saparrat es investigador del CONICET. A. Bárcena es becaria de la CICBA. P. A. Balatti es investigador de la CICBA. Este trabajo se realizó con fondos del CONICET (PIP 112-200801-01422, PIP 112 201101 00391), CICBA, UNLP, Argentina. 7. Bibliografía.- Allegrucci N, L A Elíades, A M M Bucsinszky, M N Cabello, A M Arambarri. 2007. 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