CARACTERIZACIÓN DEL PLÁSMIDO PPL395 PRESENTE EN UNA CEPA DE PAENIBACILLUS LARVAE CON RESISTENCIA A TETRACICLINA.

LEON I.E. , ; LOPEZ A.C; ALIPPI A.M

Palais Rouge. Jerónimo Salguero 1433/49

Congreso; XII CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGÍA VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2010

AAM

La loque americana es la enfermedad más grave y peligrosa que afecta a las larvas y pupas de las abejas melíferas (Apis mellifera L.). La enfermedad está ampliamente difundida en todos los países productores de miel y su agente causal es Paenibacillus larvae, bacteria Gram (+) con la capacidad de formar esporas muy resistentes al calor, agentes químicos y radiación UV. En países como Argentina, EE.UU y Canadá, se emplea tetraciclina y oxitetraciclina para el control de esta enfermedad, pero, recientemente se ha detectado resistencia en poblaciones naturales del patógeno. Dentro de los mecanismos de resistencia a tetraciclina, los más difundidos en las poblaciones bacterianas son el eflujo activo y la protección ribosomal y, en menor medida la modificación de la molécula del antibiótico. Los dos primeros se encuentran ampliamente distribuidos en bacterias Gram (-) y (+). En bacterias Gram (+) se han caracterizado 39 genes de resistencia a tetraciclina y oxitetraciclina y, algunos de estos determinantes, como el tet(K) y el tet(L) se transfieren en forma horizontal mediante plásmidos transferibles y/o transposones. El objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar el plásmido presente en la cepa PL 395 de Paenibacillus larvae con resistencia a tetraciclina. La detección de ADN plasmídico fue realizada por la técnica de Eckhard donde se observó un plásmido de 5.0 Kb al cual se denominó pPl395. La extracción del ADN plasmídico se efectuó con el kit comercial Puriprep-P®, con modificaciones, lo que permitió obtener una buena cantidad y calidad de ADN plasmídico en comparación con métodos tradicionales. Mediante PCR y usando como molde ADN plasmídico se buscó la presencia de los amplicones correspondientes a los determinantes tet(K), tet(L) y tet(M), encontrándose sólamente el tet(L) en la cepa estudiada. Para la caracterización de los genes involucrados en la replicación y en la movilización, se diseñaron los primers CAI F/sso R; CAI/F-oriT y Mob1/Mob2. Los resultados de las secuencias obtenidas nos permitieron identificar el origen de replicación simple hebra, el origen de transferencia y un segmento de los genes Mob que se traduciría en la porción funcional de las relaxasas. La técnica empleada para la extracción de plásmidos en cepas de P. larvae fue satisfactoria en cuanto a calidad y cantidad del ADN obtenido. Se encontró el determinante tet(L) asociado al plásmido que estaría involucrado en la resistencia a tetraciclina en esta bacteria. Se caracterizó el origen de replicación simple hebra (sso) involucrado en la replicación del plásmido por el mecanismo del ?circulo rodante?, así como el origen de transferencia dónde se identificó el sitio de corte. Por último se secuenció una porción de los genes Mob que estarían involucrados en la movilización del plásmido