Nuevos inhibidores de proteasas aislados de distintas variedades de "papas andinas"

OBREGON, WALTER D.; CISNEROS, JOSE S.; TELLECHEA, MARIANA; TREJO, SEBASTIAN A.; AVILES, FRANSESC X.; PRIOLO, NORA S.

Córdoba

Simposio; X Simposio Argentino y XIII Simposio Latinoamericano de Farmacobotánica; 2010

Instituto Multidisiplinario de Biología Vegetal (IMBIV-CONICET)

Objetivo e Introducción: La Fitoquímica es un área de la ciencia que tiene como objetivo el aislamiento, análisis, purificación, elucidación de la estructura y caracterización de la actividad biológica de diversas sustancias producidas por los vegetales. Los inhibidores peptídicos de proteasas (IPP) tienen importantes aplicaciones en la biomedicina, la biotecnología y el diagnóstico. La apoptosis, coagulación de la sangre y las cascadas de señalización celular son algunos de los procesos en los que participan las proteasas escindiendo proteínas o proenzimas. Una regulación precisa de la actividad proteolítica es esencial para la fisiología humana, es por esto que muchas proteasas se han convertido en importantes dianas biomédicas, siendo las dianas de casi la mitad de los fármacos del mundo. La actividad de los IPP ha motivado su uso en la biotecnología y en el diagnóstico o terapéutica de enfermedades tan diversas como el cáncer y el Alzheimer, enfermedades inmunológicas, inflamatorias, cardiovasculares y respiratorias, como el asma, e infecciones parasitarias, fúngicas y virales, como la malaria, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), las Hepatitis, entre otras. En el presente artículo se describe el aislamiento, purificación e identificación de un nuevo inhibidor de metalopeptidasas, empleando IF MALDI-TOF MS a partir de su fuente natural, de potencial importancia terapéutica y diagnóstica. Materiales y Métodos: Espectrofotometría: Esta técnica basada en la radiación absorbida o transmitida por determinadas moléculas permitió detectar actividad inhibitoria en soluciones de muestras con distinto grado de purificación. Métodos de Inmovilización: El diseño de matrices de afinidad permite la captura selectiva de biomoléculas, lo que aumenta la resolución y el rendimiento de la purificación y ahorra tiempo y recursos. Esto es especialmente importante en IPP y otras proteínas con potencialidades terapéuticas, las que requieren de un alto grado de homogeneidad. Métodos proteómicos: La atenuación de la intensidad de la señal de espectrometría de masas con el método de ionización asistida por matriz y analizador de tiempo de vuelo (IF MALDI-TOF MS: del inglés intensity fading, matrix-assisted laser desorption ionization, time of flight, mass spectrometry) posibilita detectar la formación de complejos entre moléculas, particularmente proteínas, mediante la utilización de la espectrometría de masas como transductor. El método fue desarrollado para identificar IPP a partir de mezclas naturales complejas mediante su capacidad de interacción con las proteasas que inhibe. La formación del complejo se detecta mediante la atenuación total o parcial de la intensidad iónica molecular de una proteína, después de adicionar su contraparte molecular, cuando se compara con un espectro de masas control de la muestra inicial. Una variante desarrollada posteriormente, incluye una etapa de afinidad con la proteasa inmovilizada en micropartículas poliméricas. El inhibidor retenido en la micropartícula puede ser eluído selectivamente y analizado mediante espectrometría de masas. De esta forma, la reaparición o el aumento de la intensidad de la señal en el espectro de la fracción eluída, corrobora la presencia de una molécula capaz de interactuar con la proteasa inmovilizada y descarta la posibilidad de interacciones inespecíficas. Esta metodología ha permitido identificar IPP en extractos heterogéneos que fueron posteriormente purificados y caracterizados por métodos convencionales. Electroforesis en gel: Es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. Las proteínas se desnaturalizan mediante la adición de un detergente como el dodecilsulfatosódico/dodecilfosfato sódico (SDS/SDP) y un agente reductor como el 2-mercaptoetanol. Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la proteína que les permite migrar a través del gel de poliacrilamida en relación directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo una relación carga/masa similar. De esta manera, se logró estimar el peso molecular de los IPP. Bradford: Este método se basa en que la unión del colorante Coomassie Blue G-250 a la proteína produce un corrimiento del máximo de absorbancia de 465 nm (forma roja del colorante libre) a 595 nm (forma azul del complejo colorante-proteína). El método resulta especialmente apto para la valoración de proteínas en extractos vegetales. Resultados: En este trabajo se presenta los resultados obtenidos del aislamiento de un inhibidor peptídico de obtenido de semillas de Cytisus scoparius, especie perenne, arbustiva de la familia Leguminoceae, conocida vulgarmente como Retama negra, Escobón o Retama de escobas. Por medio de IF-MALDI TOF, se pudo establecer la presencia de una molécula retenida en microcolumnas de Tripsina inmovilizada en soportes de glioxil agarosa. El siguiente paso consistió en ampliar la escala y realizar la cromatografía de afinidad del extracto de las semillas, empleando Tripsina inmovilizada en soportes de glioxil agarosa, de esta manera se obtuvo un inhibidor peptídico de unos 13.000 Da de masa molecular (SDS-PAGE) y pI de 6,9 (Isoelectroenfoque). Mediante ensayos en inhibición enzimática se pudo establecer que inhibe no solo inhibe tripsina sino también Quimotripsina. Por espectrometría de masas MALDI-TOF se determinar su masa molecular en 12915,5 Da. La secuenciación de un pequeño residuo del segmento N-terminal pudo ser realizada mediante la reacción de Edman. Conclusiones: Uno de los grandes retos de la fitoquimica es el aislamiento e identificación de sustancias provenientes de tejidos vegetales que posean potencial actividad terapéutica. Entre las biomoléculas utilizadas con este objetivo se encuentran los IPP, lo que abre un camino potencial para el desarrollo de tratamientos adecuados para diversas enfermedades. De esta manera, las herramientas y técnicas en la micro y la nanoescala han sido empleadas no sólo para la identificación y estudio molecular de los IPP. Esto pudiera producir grandes avances diagnósticos y terapéuticos, lo que a su vez, demuestra la importancia de estas tecnologías para la identificación y caracterización de nuevos IPP. La posterior identificación y purificación de IPP frente a sus respectivas proteasas, pudiera contribuir al diagnóstico o terapéutica de varias enfermedades.