Identificación de inhibidores peptídicos de proteasas con potencial aplicación biomédica obtenidos a partir de solanum tuberosum subespecie andígena variedad imillanegra (papa andina)

CISNEROS, JOSE S.; TELLECHEA, MARIANA; CECCACCI, M. FLORENCIA

Ciudad del Este

Jornada; XIX Jornadas de Jóvenes Investigadores Asociación de Universidades Grupo Montevideo (AUGM). Ciencia en el Bicentenario de los Pueblos Latinoamericanos.; 2011

ASOCIACIÓN UNIVERSIDADES ?GRUPO MONTEVIDEO?

Introducción: Fundamentos de la búsqueda de inhibidores de proteasas: Los productos naturales constituyen una de las mayores fuentes para el desarrollo de medicamentos, debido a su diversidad química y a que se les supone una toxicidad inicial limitada al encontrarse en seres vivos. Entre estos productos se encuentran los inhibidores de proteasas (IPs). Las fuentes vegetales de IPs han sido escasamente exploradas y tienen la ventaja de su extraordinaria riqueza y diversidad. Tienen menor costo de obtención y procedimientos muy sencillos, si se comparan con los procedimientos de obtención por síntesis química. Estas fuentes naturales prometen grandes esperanzas en la obtención de moléculas bioactivas novedosas y efectivas. Los inhibidores de proteasas (IPs) representan para los organismos una eficiente vía de control de la actividad de proteasas endógenas, que necesitan ser balanceadas en estado normal para obtener una proteólisis controlada. Seguramente el mayor incentivo para la búsqueda de nuevos IPs es que el control de la proteólisis representa una herramienta terapéutica valiosa, habiendo probado su utilidad no sólo en modelos experimentales sino también como agentes terapéuticos en humanos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. La actividad de los IPs obedece a su capacidad de formar complejos estables con las proteasas blanco, bloqueando, alterando o impidiendo el acceso del sustrato al sitio activo de la enzima. Los inhibidores peptídicos de proteasas (IPPs) tienen importantes aplicaciones en la biomedicina, la biotecnología y el diagnóstico. La apoptosis, la coagulación de la sangre y las cascadas de señalización celular son algunos de los procesos en los que participan las proteasas escindiendo proteínas o proenzimas. Una regulación precisa de la actividad proteolítica es esencial para la fisiología humana, es por esto que muchas proteasas se han convertido en importantes dianas biomédicas, siendo protagonistas en casi la mitad de los fármacos del mundo. La actividad de los IPPs ha motivado su uso en la biotecnología así como en el diagnóstico o terapéutica de enfermedades tan diversas como el cáncer y el Alzheimer, enfermedades inmunológicas, inflamatorias, cardiovasculares y respiratorias, como el asma, e infecciones parasitarias, fúngicas y virales, como la malaria, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), las hepatitis, entre otras. Con todo esto; y aprovechando también nuestra experiencia en el estudio bioquímico y estructural de las proteínas, sus aplicaciones biotecnológicas y la infraestructura disponible en nuestro laboratorio; se propuso a partir de muestras de papas andinas (Solanum tuberosum subespecie andígena de la variedad Imillanegra) que crecen en nuestro país; detectar, purificar, caracterizar bioquímicamente y aplicar técnicas bioinformáticas sobre nuevos inhibidores de proteasas que demuestren posibilidades de potenciales aplicaciones a nivel farmacológico y biomédico. Pueblos originarios que cultivan estas papas andinas, usan la Imillanegra para tratar enfermedades respiratorias. Fundamentos de la metodología a utilizar: Se utilizaron diversas técnicas de purificación y caracterización, entre las cuales destacamos una cromatografía de afinidad particularmente diseñada con proteasas inmovilizadas covalentemente a un soporte especial*1 y una técnica proteómica denominada Intensity Fading MALDI-TOF/MS*2, que permite detectar e identificar pequeñas cantidades de moléculas presentes en una muestra biológica. *1 Inmovilización covalente de proteasas: sobre matrices de agarosa especialmente diseñadas, para ello se usan geles de agarosa, los cuales se activan con glicidol, para generar glioxil-agarosa, que permite la unión de las proteínas en forma estable y covalente, generando un gran poder de reutilización de los rellenos de afinidad. *2 Intensity fading MALDI/TOF: La atenuación de la intensidad de la señal de espectrometría de masas con el método de ionización asistida por matriz y analizador de tiempo de vuelo (IF MALDI-TOF MS: del inglés intensity fading, matrix-assisted laser desorption ionization, time of flight, mass spectrometry) posibilita detectar la formación de complejos entre moléculas, particularmente proteínas, mediante la utilización de la espectrometría de masas como transductor. El método fue desarrollado para identificar IPP a partir de mezclas naturales complejas mediante su capacidad de interacción con las proteasas que inhibe. La formación del complejo se detecta mediante la atenuación total o parcial de la intensidad iónica molecular de una proteína, después de adicionar su contraparte molecular, cuando se compara con un espectro de masas control de la muestra inicial. La variante diseñada por nosotros incluye primariamente una etapa de afinidad con la proteasa inmovilizada en micropartículas poliméricas. El inhibidor retenido en la micropartícula puedo ser eluído selectivamente y analizado mediante espectrometría de masas. De esta forma, la reaparición o el aumento de la intensidad de la señal en el espectro de la fracción eluida, corroboró la presencia de una molécula capaz de interactuar con la proteasa inmovilizada y descarta la posibilidad de interacciones inespecíficas. Esta metodología ha permitido identificar IPPs en extractos heterogéneos que fueron posteriormente purificados y caracterizados por métodos convencionales.