Caracterización e identificación de un nuevo inhibidor de proteasas serínicas con potencial aplicación biomédica aislado de Solanum tuberosum subespecie andígena

MARTIN, JULIA; CISNEROS, JOSE S.; LUFRANO, DANIELA; OBREGON, WALTER D.; LIGGIERI, CONSTANZA

Ciego de Ávila

Congreso; IX Congreso Internacional de Biotecnología Vegetal; 2013

Universidad "Máximo Gómez Báez"

Las proteasas son enzimas que catalizan la ruptura hidrolítica de enlaces peptídicos específicos en sus proteínas blanco. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en plantas, animales y microorganismos. Los inhibidores de proteasas (IPs) participan en la prevención de la proteólisis en sitios donde esta actividad no debe producirse, así como también cumplen funciones regulatorias con el fin de garantizar una proteólisis parcial en un evento fisiológico determinado. Esto ha convertido a los IPs en moléculas muy atractivas debido a sus múltiples aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. El objetivo de este trabajo es el aislamiento y caracterización de nuevos IPs de origen vegetal utilizando como material de partida papas andinas provenientes de la provincia de Jujuy en el norte argentino. A partir de la trituración de tubérculos de Solanum tuberosum subespecie andigenum variedad Malcacha, se obtuvo un homogenato el cual fue sometido a procesos de centrifugaciones diferenciales. El sobrenadante final fue denominado Extracto Crudo (EC). Se le realizaron al mismo diferentes ensayos como cuantificación de proteínas, actividad inhibitoria sobre tripsina, SDS-PAGE e Isoelectroenfoque (IEF). Para la purificación preliminar de los inhibidores se realizaron tratamientos térmicos a 60, 65, 70, 80 y 100 ºC (TTs). A continuación se efectuaron ensayos de estabilidad a distintos pHs (1-12) y fuerzas iónicas (NaCl 0-2 M). Para seguir con el proceso de purificación se llevó a cabo una cromatografía de afinidad empleando tripsina inmovilizada. Finalmente para la caracterización e identificación de los IPs se realizaron: SDS-PAGE, IEF y huella peptídica (PMF/MALDI-TOF/MS). Los tratamientos térmicos realizados a 60 y 65 ºC fueron los que mejor conservaron la actividad inhibitoria inicial. Los inhibidores exhibieron considerable estabilidad frente a un amplio rango de pH (2 a 11) y de fuerza iónica (0,1 a 1 M). Mediante cromatografía de afinidad se obtuvo una fracción con actividad inhibitoria (FAI), la cual por SDS-PAGE mostró dos bandas electroforéticas de 15 y 21 kDa. Asimismo, en el IEF de la FAI se observaron tres bandas cuyos pIs fueron de 5.8; 6.6 y 6.8. Mediante PMF/MALDI-TOF/MS el espectro de la banda de 21 kDa identificó con un inhibidor de serín-proteasa de tipo Kunitz perteneciente a la familia de inhibidores de proteasas STI (soybean trypsin inhibitor). Se logró aislar, caracterizar e identificar a un nuevo inhibidor peptídico de serín-proteasas que posteriormente podrá ser empleado como potencial biofármaco para el tratamiento de patologías en donde estén involucradas proteasas serínicas.