Utilización de herramientas proteómicas para el screening de inhibidores de proteasas obtenidos a partir de diversas plantas de Sudamérica

OBREGON, WALTER D.; TANCO, SEBASTIAN; TELLECHEA, MARIANA; CISNEROS, JOSE S.; COLOMBO, MARIA LAURA; CECCACCI, M. FLORENCIA; LORENZO, JULIA; PRIOLO, NORA S.; AVILES, FRANSESC X.

Barcelona

Congreso; XXXIV Congreso de la SEBBM, Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular; 2011

Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM)

En los últimos años, en la investigación fitoquímica se han incorporado nuevas tecnologías, como la espectrometría de masas (EM), para la identificación de nuevas moléculas con aplicación en biomedicina, biotecnología y diagnóstico. Entre estas moléculas se encuentran los inhibidores de proteasas que en las plantas, frecuentemente están presentes en altas cantidades y pueden actuar como proteínas de reserva o como elemento de defensa. Los IPs tradicionalmente se han descubierto a partir de screenings en fuentes naturales, ya que los procedimientos de obtención por esta vía son en general menos costosos y relativamente sencillos comparados con los procedimientos de obtención de inhibidores por la vía de la síntesis química. En este trabajo se ha utilizado como método de detección de IPs la tecnología del Intensity Fading MS, técnica rápida y versátil de High-throughput screening (HTS) que permite realizar un screening rápido para la identificación de moléculas a partir de extractos complejos. Esta metodología nos ha permitido identificar IPs en extractos heterogéneos que fueron posteriormente purificados y caracterizados por métodos convencionales. En este trabajo se pretende aislar, purificar y caracterizar nuevos inhibidores de proteasas a partir de distintas fuentes vegetales. Para ello se utilizaron tubérculos de distintas variedades de Solanum tuberosum L. (Solanaceae), los cuales son ricos en estos tipos de moléculas y también se investigaron tubérculos de otras familias de plantas tales como Ullucus tuberosus (papa lisa), Oxalis tuberosa (oca amarilla), Solanum tuberosum variedad desireé (papa canadiense), semillas de Araujia Hortorum (tasi), Araujia angustifolia (tasi), Quercus robur (roble), y Cytisus scoparius (retama negra). Los extractos crudos (EC) fueron obtenidos por trituración y centrifugación de los tubérculos o semillas en buffer TRIS-HCl 0,1 M pH 8, DTT 10 mM. Se les determinó actividad inhibitoria de Tripsina, Carboxipeptidasa A (CPA), Papaína y Subtilisina. Posteriormente los EC fueron pasados por matrices de afinidad conteniendo las proteasas blanco inmovilizadas. Los inhibidores fueron eluidos y detectados por Intensity fading (IF-MALDI-TOF-MS), una técnica que posibilita detectar la formación de complejos entre moléculas, identificando así los IPs mediante atenuación de la intensidad de la señal de los péptidos buscados. Mediante cinética de inhibición y confirmando con IF-MALDI-TOF se vieron moléculas de pesos moleculares de 4,2 kDa y 21 kDa retenidas en microcolumnas de CPA y Tripsina inmovilizadas, valores esperados para este tipo de inhibidores. Uno de los retos de la fitoquímica es el aislamiento e identificación de nuevas sustancias con potencial actividad terapéutica. Los procesos de purificación mediante inmovilización enzimática han sido claves para el aislamiento de inhibidores, lo que muestra la importancia de estas tecnologías para la identificación y caracterización de nuevos IPs.1,2,3. Los IPs abren un camino para el desarrollo de tratamientos para diversas enfermedades pudiendo generar grandes avances diagnósticos y terapéuticos. 1. M. Shabab Æ Mahesh J. Kulkarni Æ M. Islam Khan, Study of Papain–Cystatin Interaction by Intensity Fading MALDI-TOF-MS. Protein J (2008) 27:7–12. DOI 10.1007/s10930-007-9102-3. 2. Villanueva J, Yanes O, Querol E, Serrano L, Aviles FX, Identification of protein ligands in complex biological samples using intensity-fading MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 2003 Jul 15;75(14):3385-95. 3. Yanes O, Villanueva J, Querol E, Aviles FX. Detection of non-covalent protein interactions by intensity fading MALDI-TOF mass spectrometry: applications to proteases and protease inhibitors. Nat Protoc. 2007;2(1):119-30.