Búsqueda de función de las proteínas virales 24K y 54K del virus de psorosis de los cítricos (CPsV) mediante transformación genética de cítricos

REYES CA; ZANEK MC; PEÑA EJ; BIEDMA ME; ROMANOWSKI V; PLATA MI; COSTA N; GRAU O; GARCIA ML

Boca Chica, República Dominicana

Congreso; V Encuentro Latinoamericano y del Caribe de Biotecnología Agrícola, REDBIO 2004; 2004

REDBIO

La producción citrícola argentina se ve afectada por una enfermedad denominada Psorosis de los cítricos que se disemina naturalmente provocando importantes pérdidas económicas. El agente causal, Citrus psorosis virus (CPsV), miembro tipo del género Ophiovirus, posee un genoma tripartito de polaridad negativa. El RNA1 posee dos ORF, codificando la RNA polimerasa viral (280K), y una proteína de 24KDa  (24K) de función desconocida. El RNA 2 contiene un ORF que codifica una proteína de 54KDa (54K) probablemente no estructural y el RNA 3 la proteína de cubierta viral (48K).  Estudiar la función de las proteínas 24K y 54K, su localización subcelular, tanto en el cítrico transgénico como en hospedantes herbáceos, y su posible relación con la patogenicidad del virus en su hospedante natural (manifestación de síntomas, efectos citopáticos, etc).  Se obtuvieron cítricos transgénicos que expresan las proteínas 54K o 24K de CPsV mediante la transformación de segmentos internodales de tallos de Naranjo Dulce Pineapple con Agrobacterium tumefaciens. Los brotes regenerados fueron seleccionados mediante ensayo de GUS (54K), o fluorescencia GFP (24K), analizados por PCR y, posteriormente, injertados in vitro sobre Citrange Troyer. Además se desarrollaron sueros específicos que reconocen las proteínas 24K y 54K. Para ello se clonó el ORF de la proteína 24K fusionado a His-tag, expresándose en el sistema heterólogo Bac to Bac, y se purificó por columna de afinidad. El ORF completo de la 54K también fue fusionado a His-tag y expresado en E. coli (sistema pET). Posteriormente, estas proteínas purificadas fueron utilizadas para inmunizar conejos y ratones. Los antisueros fueron analizados por dot-blot utilizando fosfatasa alcalina como sistema de detección.  Se obtuvieron quince líneas transgénicas para cada proteína, de las cuales diez, analizadas por la técnica de Southern blot, contenían de 1 a 3 copias integradas del transgén. Los resultados de dot-blots indicaron que los sueros detectan alrededor de 1 ng de proteína. Las líneas trasngénicas y los sueros obtenidos serán utilizados como herramientas para avanzar en el conocimiento de la función de las proteínas virales. Esto permitirá dirigir futuras estrategias de resistencia al virus iniciando el camino hacia la erradicación de la enfermedad.