Optimización de RT-qPCR para la detección de viroides de cítricos

JORIS GIOVANNA; CONTI, G.; GOMEZ, C.A.; REYES CA

Simposio; XIV Simposio REDBIO Argentina 2023; 2023

Los cítricos, al igual que otros cultivos, son sensibles a diversos patógenos lo que trae aparejado consecuencias en la economía de las regiones. Dentro de los agentes que afectan a los cítricos se encuentran los viroides que poseen un tamaño pequeño de entre 246-401 nucleótidos. Constan de una sola molécula circular de ARN simple hebra, y su estructura está definida por el número y secuencia de nucleótidos que lo componen. Según el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) los viroides que afectan a cítricos son Citrus bent leaf viroid (CBLVd), Citrus dwarfing viroid (CDVd), Citrus viroid V (CVd-V), Citrus viroid VI (CVd-VI), Citrus viroid VII (CVd-VII), Citrus bark cracking viroid (CBCVd), Hop stunt viroid (HSVd) y Citrus Exocortis viroid (CEVd). En Argentina, hasta la fecha se ha reportado la presencia de CEVd, HSVd, CDVd y CBLVd, y la aparición de los mismos está controlada periódicamente en Plantas Madres de Cítricos por el Programa Nacional de Certificación de Cítricos, fiscalizado por INASE. Actualmente, los diagnósticos aprobados son indexing biológico, sPAGE e hibridación molecular. El objetivo de este trabajo fue poner a punto y optimizar las cuatro RT-qPCR para esos viroides que contribuirá a una detección más rápida y de mayor sensibilidad.En una primera instancia para el ajuste de las RT-qPCR se utilizaron extracciones de RNA de plantines de Cidra Etrog Arizona 861-S1 (Citrus medica L.) inoculados con muestras testigos de viroides pertenecientes al banco de la Estación Experimental Agropecuaria INTA Concordia. Algunos se encuentran individualmente, como es CEVd, HSVd y CBCVd, y otros en mezclas de CEVd-HSVd-CDVd, CEVd-HSVd y CBLVd-CDVd. Los primers utilizados son los diseñados por Bernard y Duran-Vila (2006), siendo F4/R1 para CEVd, F1/R1 para HSVd, F3/R1 para CDVd, y F1/R1 para CBLVd. La reacción de RT seguida de PCR cuantitativa (RT-qPCR, en un solo paso) se llevó a cabo con el kit iTaq Universal SYBR Green One-Step (BIO-RAD), 300nM de cada primer y diferentes concentraciones de RNA total según el viroide. Las condiciones de temperatura y ciclado fueron los indicados por el fabricante ajustados para cada par de primer específico. Una vez optimizadas las condiciones para las RT-qPCR, se procedió a analizar 108 plantas de Cidra Etrog inoculadas con muestras de campo con sintomatología típica de infección de la zona citrícola del Río Uruguay y también muestras control. Los plantines de C. Etrog son utilizados como indicadores biológicos de viroides por su gran susceptibilidad y por amplificarlos naturalmente.Los resultados obtenidos de las RT-qPCR de estas muestras también fueron los esperables. De esta manera se consiguió ajustar los 4 protocolos de RT-qPCR, validándolos para diferentes tipos de muestras. Estos protocolos podrán ser adoptados en un futuro cercano por el INASE para complementar y/o reemplazar los diagnósticos existentes.