Inducción in vitro de callos de naranjo dulce a partir de segmentos internodales y tejido nucelar para su utilización en ensayos de edición génica

MUSSO F; FERREYRA CORDERO L; GIMENEZ P; GOCHEZ, A.M.; VERA-BRAVO C; GARCIA ML; REYES CA

Simposio; XIV Simposio REDBIO Argentina 2023; 2023

Argentina es líder en la producción de frutas frescas para consumo interno y exportación. Uno de los principales factores limitantes para la producción de cítricos son las enfermedades, siendo el Huanglongbing (HLB) la más destructiva a nivel mundial. Esta enfermedad está asociada a las bacterias Candidatus Liberibacter species y es transmitida a través del insecto Diaphorina citri.Los patógenos activan genes de susceptibilidad en las plantas para establecer una interacción compatible y causar síntomas. La tecnología CRISPR/Cas9 permite la edición de genes endógenos y puede ser aplicada a genes de susceptibilidad a HLB, para generar plantas resistentes o tolerantes a la enfermedad. Existen dos estrategias principales para la transformación genética con CRISPR/Cas9: la introducción estable de los genes de este sistema en el genoma de la planta huésped o la expresión transitoria de sus componentes a través de ribonucleoproteínas preensambladas, lo que permite generar plantas editadas sin transgenes. En ambos casos, es necesario optimizar el cultivo de explantos de cítricos para su posterior transformación y regeneración de plantas. En este trabajo se indujeron cultivos in vitro de callos de Citrus sinensis a partir de 2 tipos de explantos: segmentos internodales de plantines de la variedad “Pineapple” y tejido nucelar de semillas de frutos inmaduros de la variedad “Valencia late”.Varetas de plantines de invernadero de aproximadamente un año se desinfectaron para luego cortar segmentos internodales que se cultivaron en medio sólido Murashige & Skoog (MS) con las hormonas ácido naftalenacético (ANA) y bencilaminopurina (BAP), en oscuridad hasta que se desarrollaron los callos. Se desprendieron las masas de callos formados en los extremos y se subcultivaron en el mismo medio, de manera de establecer líneas individuales de las que se observó morfología, color y cinética de crecimiento. Se iniciaron posteriormente cultivos de callos en medio líquido y se extrajeron alícuotas para observar las células en suspensión al microscopio, donde se pudieron registrar las características morfológicas típicas.Para la extracción de nucelas, se esterilizó la superficie de frutos de campo verdes inmaduros de 12 a 14 semanas de la variedad Valencia late y se extrajeron las semillas de las cuales se retiró el tejido nucelar, eliminando los embriones zigóticos. Dicho tejido se cultivó en medio solido MS con extracto de malta y las hormonas ANA y BAP, en oscuridad hasta la aparición de callos. Callos seleccionados se disgregaron y subcultivaron en medio líquido. Se observó también la regeneración de embriones que posteriormente originaron brotes y raíces a partir de tejido nuclear cultivado con un fotoperiodo de 16/8 horas.Al presente se cuenta entonces con líneas de callos derivados de estos dos tipos de explantos que serán utilizados para la transformación estable y/o transitoria con los componentes necesarios para la edición genética de genes de susceptibilidad a HLB.