Generación de construcciones para la edición por CRISPR/Cas9 de genes de susceptibilidad a Huanglongbing en Citrus sinensis

FERREYRA CORDERO L; MUSSO F; MASSA G; DECIMA ONETO C; REYES CA

Simposio; XIV Simposio REDBIO Argentina 2023; 2023

Argentina es uno de los principales productores de cítricos a nivel mundial, siendo uno de los cultivos más importantes del país. El Huanglongbing (HLB) es una enfermedad devastadora globalmente que pone en peligro toda la producción y el valor económico de las plantaciones. El agente asociado a la enfermedad es la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), y una vez que el árbol está infectado, no tiene cura. El presente trabajo se enmarca en un proyecto que apunta a dar una solución sustentable a la inminente pérdida de plantaciones de cítricos por HLB, centrándose en la prevención de la diseminación de la enfermedad. Se propone como estrategia la edición de genes de susceptibilidad de Citrus sinensis (naranjo dulce) a la bacteria causante de la enfermedad mediante la tecnología CRISPR/Cas9. Se pretende editar un gen de susceptibilidad a HLB previamente reportado, CsA del genoma de C. sinensis, así como también otros dos genes de susceptibilidad candidatos: CsB y CsC. El objetivo final es obtener líneas knock-out para sendos genes. Para tal fin se han diseñado y seleccionado mediante herramientas bioinformáticas las mejores moléculas de RNA guías (sgRNAs) para cada uno de los genes de acuerdo a su secuencia, estructura óptima de plegamiento y riesgo de off-targets. Éstas sgRNAs fueron sintetizadas e introducidas en vectores utilizando un sistema de clonado de dos niveles de tipo Golden Gate desarrollado por Voytas Lab. En el primero de los niveles se ensamblaron los módulos de expresión para las sgRNAs bajo el control del promotor U6, óptimo para dirigir la transcripción de moléculas cortas de RNA, la secuencia especifica de la sgRNA diseñada y una secuencia conservada denominada scaffold en posición downstream que es esencial para otorgar la estructura tridimensional de la molécula y permitir la interacción con la enzima Cas9. En el segundo nivel, se clonaron combinaciones de dos sgRNAs para un mismo gen junto a un módulo para la expresión de la enzima nucleasa Cas9 y un módulo que otorga resistencia a kanamicina como marcador de selección para la transformación genética de plantas vía Agrobacterium tumefaciens.Los vectores obtenidos fueron verificados mediante mapas de restricción y por secuenciación. Se prevé utilizarlos para transformar segmentos internodales de C. sinensis con la cepa EHA105 de A. tumefaciens de manera estable y luego de la identificación y caracterización de las ediciones, someter dichas líneas a ensayos de desafío con Candidatus liberibacter asiaticus para evaluar efectos de tolerancia o resistencia a la enfermedad.