Inducción in vitro de callos de Citrus sinensis para la utilización en experimentos de edición de genes de susceptibilidad a HLB

FERREYRA CORDERO L; MUSSO F; GIMENEZ; GOCHEZ, A.M.; VERA BRAVO C; GARCIA ML; REYES CA

Concordia

Congreso; X Congreso Argentino de Citricultura; 2023

La enfermedad Huanglongbing (HLB) también conocida como Greening o “enverdecimiento de los cítricos” es considerada una de las enfermedades más destructivas de este cultivo en el mundo. Afecta a casi todas las variedades de cítricos, siendo las toronjas, naranjas dulces, algunos tangelos y mandarinas las más susceptibles y las limas, limones, naranjas agrias y naranjas trifoliadas las menos. Desarrollos recientes en la tecnologías de edición genómica tienen el potencial de facilitar la producción de cultivares de cítricos genéticamente modificados pero que carezcan de transgenes. Las tecnologías de edición genómica basadas en CRISPR/Cas9-single guide RNA (Cas9-sgRNA) contra genes de susceptibilidad de la planta al agente causal de la enfermedad, Candidatus liberbacter, ofrecen una alternativa para la obtención de tolerancia. En el presente trabajo se indujeron callos in vitro a partir de diferentes explantos provenientes de las variedades Pineapple y Valencia late de Citrus sinensis. Se extrajeron segmentos internodales de plantines cultivados en invernadero de aproximadamente un año de la variedad Pineapple y se cultivaron en medio MS adicionado con las hormonas vegetales ANA (10 mg/L) y BAP (0.25 mg/L) hasta el desarrollo de callos (entre 2 y 3 semanas) con fotoperíodo 16/8. Los mismos se desprendieron de los segmentos y se cultivaron en placa durante aproximadamente 10 semanas de manera de establecer líneas individuales de las que se observó morfología, color y cinética de crecimiento. De las líneas obtenidas se seleccionaron 3, se disgregaron los callos y se sub-cultivaron en medio líquido con la misma composición de hormonas. Las células se observaron al microscopio registrándose características morfológicas normales. Para el caso del tejido nucelar se utilizaron frutos de campo verdes inmaduros de 12 a 14 semanas y de aproximadamente 5 cm de diámetro de la variedad Valencia late. Se procedió a extraer el tejido nucelar de las semillas y antes de ser cultivadas se extrajeron los embriones zigóticos. El tejido nucelar se creció en medio MS suplementado con extracto de malta con y sin el agregado de BAP (3mg/L) y ANA (10mg/L). Los explantos fueron crecidos en oscuridad por 6 a 8 semanas hasta la aparición de callos. Los mismos fueron separados y sub-cultivados en medio líquido con la misma composición.Al presente se cuenta entonces con líneas de callos derivados de estos dos tipos de explantos que serán utilizados para la transformación estable y/o transitoria con los componentes necesarios para la edición genética de genes de susceptibilidad a HLB.