Evaluación de la cromatina espermática mediante la tinción de azul de toluidina

CARRETERO MI; MONACHESI N; ALLERA C; ARRAZTOA CC; CHAVES MG; NEILD DM

Taurus

Ediciones Taurus

Lugar: Ciudad Autónoma de Buenos Aires; Año: 2018 p. 38 - 41

1515-3037

La incorporación de técnicas de reproducción asistida como la fertilización in vitro y la inyección intracitoplasmática de un espermatozoide (ICSI: Intracytoplasmic Sperm Injection) ha generado un mayor interés en la evaluación del ADN espermático. Esto se debe, principalmente, a que en la ICSI el espermatozoide no requiere estar vivo y/o moverse, pero si necesita que su cromatina se encuentre intacta. Por otra parte, espermatozoides con ADN dañado son capaces de fertilizar y transmitir material genético defectuoso con consecuencias adversas para el desarrollo embrionario (Aitken y Krausz, 2001). Los espermatozoides son incapaces de reparar el ADN dañado porque no contienen enzimas funcionales de reparación (Drost y Lee, 1995) y aunque después de la fertilización, el ovocito pueda reparar un cierto nivel del ADN dañado (Genesca y col, 1992), esto puede resultar en un pobre o defectuoso desarrollo embrionario y en pérdidas embrionarias tempranas (Ahmadi y Ng, 1999). Por todas estas razones sería beneficioso incorporar técnicas de evaluación del ADN espermático al examen de rutina de la calidad seminal, que además permitiría estimar con mayor precisión la capacidad fecundante de un macho reproductor.Se han utilizado varias técnicas para estudiar los defectos del ADN espermático, sin embargo, la mayoría de ellas son laboriosas y costosas debido a que requieren equipamiento complejo y/o la utilización de kits, a veces no disponibles comercialmente en nuestro país. La tinción con Azul de Toluidina (AT) es bastante simple y permite evaluar el grado de condensación o compactación de la cromatina espermática. Es un colorante nuclear catiónico que al unirse al ADN de espermatozoides con cromatina descondensada, da lugar al color metacromático azul-violeta. Esto se debe a la formación de agregados de AT interactuando iónicamente con los fosfatos negativos de los nucleótidos. La coloración celeste (ortocromática) que se observa en espermatozoides con cromatina condensada, se debe a la participación de un número mucho más reducido de moléculas de AT que se unen como monómeros al ADN, mediante intercalación o por unión iónica (Carretero y col., 2009). La completa neutralización de los grupos fosfato por las argininas de las protaminas (Pogany y col., 1981) y la ocurrencia de entrecruzamientos entre protaminas (Balhorn R., 1989) son los principales factores responsables de la reducida afinidad de la cromatina compacta del espermatozoide maduro por los colorantes catiónicos. La tinción de AT es sencilla y económica (sólo se necesita un microscopio óptico y el colorante) y ha sido utilizada en varias especies. Una ventaja de esta técnica radica en que se pueden utilizar agentes reductores de los grupos disulfuro de las protaminas como el ditiotreitol (DTT) o el mercaptoetanol (ME), como controles positivos de la tinción con AT. Esto se debe a que estos compuestos permiten que las proteínas se relajen y que los grupos fosfato del ADN queden disponibles y accesibles a la unión del colorante (Barrera y col., 1993; Carretero y col., 2009; 2010a; 2010b). En la técnica original se emplea una hidrólisis ácida previa a la tinción de AT, con la finalidad de aumentar la sensibilidad de la misma (humano: Erenpreiss y col., 2004; Tsarev y col., 2009; bovino: Beletti y Mello, 1996; Beletti y col., 2005; canino: Flores y col., 2017). Estos autores observaron que los espermatozoides que tienen una cromatina altamente compacta son apenas afectados por la hidrólisis ácida y en consecuencia manifiestan con intensidad la ortocromasia (coloración celeste). Por el contrario, en los espermatozoides con una cromatina descondensada, las protaminas pueden ser parcialmente extraídas por la hidrólisis ácida permitiendo que las moléculas de AT se unan a los grupos fosfato y se manifieste la metacromasia (coloración oscura).