CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO MASLÍNICO EN HÍGADOS DE RATAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE EN TANDEM CON IONIZACIÓN POR ELECTROSPRAY Y DETECCIÓN POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS/MASAS (LC ESI MS/MS)

ADDONA S; BARCAROLO D; ZAYAS M; ANGELI E; HUBER E; REBELINDO E; SALINAS F; NEME L; ORTEGA HH; HEIN GJ

Esperanza

Jornada; VII Jornada de difusión de la investigación y extensión; 2019

Facultad de Ciencias Veterinarias (Universidad Nacional del Litoral)

El ácido maslínico (ácido [2α,3β]-2,3-dihidroxiolean-12-en-28-oico)es un triterpeno pentacíclico que se encuentra presente en varias fuentesnaturales, como por ejemplo en las hojas y cera de la piel de aceitunas (1-3).Estudios recientes han demostrado numerosas actividades biológicas de estecompuesto que resultan beneficiosas para la salud de seres humanos y deanimales (4). Entre sus aplicaciones, se utiliza en producciónanimal como aditivo alimentario para estimular el crecimiento. El objetivo de este trabajo fue desarrollar unametodología analítica para identificar y cuantificar ácido maslínico en hígadosde ratas por cromatografía líquida de alta performance en tandem con ionizaciónpor electrospray y detección por espectrometría de masas/masas (LC ESI MS/MS). Se utilizaron 80 ratas divididas en dos grupos: Grupoexperimental (20 machos y 20 hembras; dosis de ácido maslínico 1000 mg/kg/día)y Grupo control (20 machos y 20 hembras; sin sustancia de ensayo). La dosis deácido maslínico fue administrada por vía oral a través del alimento balanceado.Los animales tuvieron libre acceso al alimento durante todo el estudio.Finalmente, las ratas fueron sacrificadas a los 7, 28, 56 y 91 días, con unatolerancia de ± 10%. Para la identificación y cuantificación del analito seutilizaron: un cromatógrafo líquido (UFLC) Shimadzu compuesto por 2 bombasmodelo LC-20AD XR, desgasificador modelo DGU-20A3, inyector automático modeloSIL-20AC XR con horno calefactor de columna, y un espectrómetro de masas ABSCIEX modelo 3200 QTRAP triple cuadrupolo (MS/MS) hibrido con trampa de ioneslineal con interfaz de ionización por electrospray (ESI). Los reactivosempleados (acetonitrilo, agua, metanol, formiato de amonio, hidróxido de amonioy acetato de etilo) fueron de grado analítico. Se optimizaron las condicionesoperativas del espectrómetro para determinar el compuesto de interés y suestándar interno (ácido betulínico). Brevemente, la preparación de muestrasconsistió en el pesaje de 0,2 g de tejido en tubos eppendorf de 2 mL decapacidad y la adición de 100 µL de agua grado analítico. Se fortificaron lasmuestras con el estándar interno hasta una concentración nominal de 40 ppm yluego se agregó 1400 µL de acetato de etilo frío. Se vorterearon y sonicarondurante 15 min, se centrifugaron a 3500 g y 4°C durante 15 min y se trasvasaronlos extractos resultantes a tubos de vidrio KHAN (5 mL). Se repitió laoperación con los residuos de muestras para obtener un segundo extracto que secombinó con el primero; se evaporaron los extractos resultantes hasta sequedadbajo corriente de nitrógeno (10 psi) y en un baño con agua a 45ºC durante 20min y se reconstituyeron los extractos secos con 200 µL de fase móvil,sonicándose durante 15 min. Finalmente se filtraron los extractosreconstituidos y se dispusieron en los correspondientes viales para suinyección en el cromatógrafo. La calibración se llevó a cabo en una matriz testigode hígados de ratas, para el siguiente rango analítico nominal: 0,25, 0,5, 1, 2y 4 mg/kg. Se calcularon los límites de detección (LD) y de cuantificación (LQ)para el compuesto de interés en hígados de ratas, siendo 0,20 mg/kg y 0,60mg/kg, respectivamente. El estudio de recuperación se realizó en los nivelesbajo, medio y alto del rango analítico, obteniéndose valores porcentuales de:115, 98 y 89, respectivamente. Se desarrolló una metodología analítica paraidentificar y cuantificar ácido maslínico en hígados de ratas por LC ESI MS/MS,obteniéndose información valiosa y complementaria al protocolo diseñado para elestudio de ácido maslínico propuesto en el CMC. Resulta importante destacar quecon los resultados obtenidos se pudo aportar información sobre la acumulación ymetabolización del ácido maslínico en hígado, permitiendo a la empresacontratante avanzar con el registro de un suplemento nutricional en SENASA.