DETERMINACIÓN DE FENITOÍNA EN SALIVA POR LC-MS/MS: DESARROLLO Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO

BALDO, MATÍAS N; LORENZI, ANA C; HEIN, GUSTAVO J; MURGUIA, MARCELO C

Los Cocos - Córdoba

Congreso; 1er Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2012

SAEM

INTRODUCCIÓN El empleo de saliva como matriz biológica para la determinación de fármacos en plasma humano, ofrece diferentes ventajas: a) es un método sencillo y no invasivo, lo que permite el monitoreo terapéutico de drogas (MTD) y la realización de estudios farmacocinéticos en poblaciones especiales (ej.: niños y ancianos); b) las concentraciones de fármacos en saliva reflejan su fracción libre (no unida a proteínas), es decir, su fracción terapéutica activa(1,2). La Fenitoína (PHT) integra la familia de los anticonvulsivantes ampliamente utilizados en la práctica médica, siendo una droga de uso común para los tratamientos de epilepsia. Debido al estrecho margen terapéutico que presenta, resulta de vital importancia su constante monitoreo(3,4). El alto índice de interacción entre la Fenitoína y las proteínas plasmáticas (10% fracción no unida), se ve reflejado en los bajos niveles de este principio activo en saliva, lo que representa una dificultad analítica que demanda el empleo de tecnologías de Espectrometría de masas. OBJETIVOS Desarrollar y validar un método analítico para la determinación de Fenitoína en saliva utilizando LC-MS/MS, para su potencial aplicación en el Monitoreo Terapeútico de Drogas (MTD) y en Estudios de Bioequivalencia. Materiales y Métodos El sistema de LC-MS/MS consistió de un cromatógrafo líquido ultra rápido LC 20AD, (Shimadzu), desgasificador DGU-20A3 (Shimadzu), Inyector automático SIL-20A XR (Shimadzu), columna Hypersil Gold (C-18, 100 x 2.1 mm, 3 µm) y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolos API 3200 (ABSciex) con interfaz de ionización por electrospray (ESI). Se trabajó en modo MRM siendo las transiciones: 251.1→102.0; 251.1→208.0 para Fenitoína, y 316.0→269.9 para Clonazepam como Estándar Interno (EI). La fase móvil consistió de Acetonitrilo(ACN)/acetato de amonio 3 mM en agua, utilizando un sistema de gradiente. La preparación de muestra consistió en una etapa de extracción, por precipitación de proteínas (a pesar de sus bajos niveles encontrados en la matriz estudiada) y la posterior dilución con agua. Finalmente la muestra es inyectada al cromatógrafo. Los parámetros a evaluar fueron: límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ), linealidad, precisión, exactitud, efecto matriz, porcentaje de recuperación y estabilidad corto plazo. Resultados Las curvas de calibración fueron preparadas en saliva con objeto de disminuir la supresión iónica (a pesar de que el efecto matriz es mínimo). El método fue lineal en el rango de trabajo estudiado (5-1337 µg/L; r > 0.999). El LOD fue de 5 µg/L y el LOQ de 15 µg/L. El rango en el que se evaluó la recuperación fue 18-936 µg/L, obteniendo un porcentaje del 95-105 % en los niveles evaluados. La precisión y exactitud del método fueron satisfactorias, observándose valores de RSD menores al 15 % en todos los casos. Además se evaluó la estabilidad de la muestra a corto plazo a través de tres ciclos de congelado-descongelado, en tres niveles de concentración (bajo, medio y alto) obteniendo un Bias de 14.5%, 3.6% y 1.3%, respectivamente. CONCLUSIONES El método analítico permitió la detección y cuantificación de las bajas concentraciones del principio activo (PHT) en saliva, representando un método sencillo, rápido, de bajo costo y confiable. La Espectrometría de Masas representa una compleja tecnología que promete ser una herramienta analítica de gran importancia en el área del Monitoreo Terapéutico de Drogas y para estudios de Biodisponibilidad Comparada, ya que permite el dosaje de principios activos en matrices no convencionales como la saliva, ofreciendo las ventajas atribuidas a la bioseguridad y al uso de técnicas de extracción no invasivas. REFERENCIAS (1) Liu, H; Delgado, MR. Therapeutic Drug Concentration Monitoring Using Saliva Samples: Focus on Anticonvulsants. 1999. Clin. Pharmacokinet., 36(6): 453 ? 470. (2) Pichini, S; Altterl, I; Zuccaro, P; Pacifi, R. Drug monitoring in nonconventional biological fluids and matrices. 1996. Clin. Pharmacokinet., 30: 211 ? 28. (3) McNamara, JO. Fármacos Eficaces para el Tratamiento de las Epilepsias. En Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica (9na Edición); Goodman & Gilman?s, Eds.; McGraw-Hill Interamericana S.A.: Madrid. 1996. Vol. I: 491 ? 519. (4) Hayes, G; Kootsikas, ME. Reasessing the lower end of the phenytoin therapeutic range: a review of the literature. Annals of Pharmacotherapy. 1993. 27: 1389 ? 1392.