DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UNA METODOLOGÍA ANALÍTICA APLICADA AL ESTUDIO DE BIODISPONIBILIDAD COMPARATIVA DE CLONAZEPAM 2 MG EN VOLUNTARIOS SANOS POR MEDIO DE LC-MS/MS

MUHN, MARÍA A; HUNZICKER, GABRIEL A; HEIN, GUSTAVO J; MURGUIA, MARCELO C

Los Cocos - Córdoba

Congreso; 1er Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2012

SAEM

INTRODUCCIÓN El Clonazepam pertenece a la familia de las benzodiacepinas y presenta una alta potencia ansiolítica en relación con su función depresiva del Sistema Nervioso Central; sin embargo posee propiedades sedantes-hipnóticas en grados variables y estas propiedades se aprovechan con amplitud en clínica: sobre todo para promover el sueño, tratar la ansiedad generalizada, fobias, crisis y trastornos de pánico, entre otras. Además, dada su menor capacidad de causar depresión letal del SNC, las benzodiacepinas han desplazado a los barbitúricos como sedantes-hipnóticos([i],[ii]). Debido a los bajos niveles de Clonazepam encontrados en plasma humano (0.7-20 ng/mL), luego de la administración de una dosis de 2 mg, la espectrometría de masas en tándem representa una herramienta analítica necesaria para su aplicación en el campo de la Biodisponibilidad Comparada. OBJETIVO Desarrollar y validar una metodología analítica de LC-MS/MS para su aplicación en un estudio de Biodisponibilidad Comparada de dos formulaciones que contienen Clonazepam en comprimidos de 2 mg, a fin de demostrar la Bioequivalencia terapéutica de ambos productos (PRUEBA y REFERENCIA). MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizó un sistema de LC-MS/MS constituido por un cromatógrafo líquido ultra rápido LC 20AD (Shimadzu), desgasificador DGU-20A3 (Shimadzu), Inyector automático SIL-20A XR (Shimadzu), columna Hypersil Gold (50 x 2.1 mm, 1.9 µm) y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolos API 3200 (ABSciex) con interfaz de ionización por electrospray (ESI). Se trabajó en modo MRM siendo las transiciones 316.0→269.9; 316.0→214.1 para Clonazepam y 251.1→208.0; 251.1→102.0 para Fenitoína empleada como Estándar Interno (EI). La fase móvil consistió en Acetonitrilo (ACN)/ácido fórmico 0.15 % (60:40), a un flujo de 0.25 mL/minuto. En un tubo de 2 mL se colocaron 300 µL de plasma, se agregaron 300 µL de ACN y 300 µL de EI disueltos en ACN. Se vortereó 1 minuto y luego se centrifugó 3 minutos a 3000 ´ g. Se trasvasaron 400 µL del sobrenadante a un vial de HPLC y se agregaron 650 µL de H2O. Finalmente se vortereó durante 10 seguntos y se procedió a su inyección. El estudio de Bioequivalencia consistió en un diseño cruzado aleatorio de dosis única, con dos secuencias, dos periodos y un lavado de 21 días involucrando 24 voluntarios masculinos. Se realizó la comparación entre la administración de 2 mg de Clonazepam contenidos en 1 comprimido de la formulación de PRUEBA, respecto de 1 comprimido de 2 mg de la formulación de REFERENCIA. Una dosis única de cada formulación fue administrada con 240 mL de agua a cada voluntario en ayunas. Luego de las dosis, se tomaron muestras de sangre seriadas durante 120 horas y se separó el plasma para su posterior análisis. Para determinar la bioequivalencia de Clonazepam, se han seguido los lineamientos recomendados por normativas nacionales e internacionales([iii],[iv]), presentando los perfiles (Concentración vs. Tiempo) y evaluando la bioequivalencia con las relaciones de los parámetros farmacocinéticos: Área Bajo la CurvaPueba/Área Bajo la CurvaReferencia (ABCP/ABCR) y Concentración plasmática máximaPrueba/Concentración plasmática máximaReferencia (CmáxP/CmáxR). A partir de la cuantificación de la concentración plasmática de Clonazepam a los distintos tiempos de muestreo, se calcularon las variables por medio de un método no compartamental utilizando el programa WinNonlin Professional v.6.02 (Pharsight, Mountain View, CA). Resultados La recuperación de Clonazepam en plasma humano estuvo entre 93.4-108.9 %, la curva de calibrado fue lineal en el rango de 1.0-22.0 ng/mL (r > 0.998). La exactitud interdía se encontró entre 98.2-106.5 % y la precisión interdía entre 3.6-15.0 % para los niveles alto y bajo de los controles de calidad, respectivamente. El límite de detección fue de 0.5 ng/mL y la estabilidad de Clonazepam en plasma a -20°C se evaluó satisfactoriamente hasta los 220 días. En la Tabla 1. Se muestran los parámetros farmacocinéticos (media aritmética ± desviación estándar) obtenida a partir de los parámetros farmacocinéticos calculados para cada voluntario (n=24). Tabla 1. Parámetros Farmacocinéticos para Clonazepam 2 mg. Medicamento ABC0-t (ng h/mL) ABC0-∞ (ng h/mL) Cmáx (ng/mL) PRUEBA 442 ± 144 514 ± 208 13.9 ± 3.7 REFERENCIA 425 ± 156 478 ± 202 13.3 ± 4.1 El análisis estadístico realizado para la determinación de la bioequivalencia, se ha basado en el análisis de las medias de los parámetros farmacocinéticos ABC0-t, ABC0-∞ y Cmáx de Clonazepam, transformados logarítmicamente, mediante análisis de la varianza (ANOVA). Utilizándose para demostrar la bioequivalencia, el cociente PRUEBA/REFERENCIA de los parámetros farmacocinéticos transformados logarítmicamente, calculados para un intervalo de confianza del 90% (IC 90%). Los resultados se expresan en la Tabla 2. Tabla 2. Análisis Estadístico de datos transformados logarítmicamente. Parámetro Farmacocinético Punto Estimado IC 90 % LI LS ABC0-t 104.5 96.5 113.1 ABC0-∞ 108.0 99.0 117.9 Cmáx 105.7 98.3 113.7 CONCLUSIONES La metodología desarrollada y validada en el presente trabajo resalta la utilidad de la espectrometría de masas en tandem como herramienta analítica para la determinación de bajas concentraciones de Clonazepam como las encontradas en el presente Estudio de Bioequivalencia, además del bajo costo, rapidez y sensibilidad del método. El estudio de Biodisponibilidad comparada para la formulación de PRUEBA frente a la de REFERENCIA, se encuentran dentro del rango de aceptación establecido para concluir que existe Bioequivalencia entre ambas formulaciones, demostrando que estos productos son intercambiables en la práctica médica, garantizando su eficacia y seguridad. ([i]) Charney, D; Mihic, S; Harris, R. Hipnóticos y Sedantes. En Goodman & Gilman's. Las Bases Farmacológicas de las Terapéuticas (11va. Edición); Goodman & Gilman´s, Eds; McGraw-Hill: New York, 2006, Cap. 16. ([ii]) Armijo, J. Fármacos antiepilépticos y anticonvulsivos. En Farmacología Humana (3ra Edición); MASSON, S.A.: Barcelona, 1997, Cap. 29; 489 ? 512. ([iii]) Guidance for Industry. Bioavailabilty and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products- General Considerations. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Octubre 2000. FDA. ([iv]) Resolução - RDC Nº 27, Maio 2012. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. ANVISA. Brasil.