Evaluación de la expresión proteica del factor de necrosis tumoral alfa e interleucina 6 en biopsias hepáticas de bovinos lecheros durante el periodo de transición

INVINKELRIED JP; ANGELI E; BARCAROLO D; BENZ M; ORTIZ DE ZÁRATE J; REY F; SALVETTI NR; HEIN GJ; MATILLER V

Esperanza

Jornada; X Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión; 2022

Facultad de Ciencias Veterinarias (UNL)

El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de dos factoresproinflamatorios: TNFalfa e IL-6 en muestras de biopsias hepáticas por medio dela técnica de inmunohistoquímica indirecta (IHQ). Se seleccionaron cinco vacas Holstein, próximas a entrar ensu segunda a cuarta lactancia, de una granja lechera comercial en pastoreo enHipatia (31°07'S, 61°03'W), Santa Fe, Argentina. Los animales fueron examinadosclínicamente previo y durante el ensayo, y no mostraron evidencia de trastornostales como retención de placenta, fiebre de leche clínica, mastitis, metritis,cetosis clínica, abomaso desplazado, cojera y/o trastornos gastrointestinalesclínicos. En este estudio solo se incluyeron animales sanos. Se tomaronmuestras de sangre de vena yugular y de biopsias hepáticas a los 21 (±3) díasantes de la fecha prevista de parto, y 7 (±3) y 21 (±3) días posteriores alparto. Las biopsias de aproximadamente 500 mg de tejido hepático fueronobtenidas por punción según lo descripto por Angeli y col.1. Lasmuestras fueron fijadas en formaldehído tamponado al 4% durante 4-6 h yprocesadas de acuerdo a las técnicas histológicas de rutina hasta su inclusiónen parafina. Se efectuaron cortes seriados, de 4 μm de espesor con un micrótomoLeica R450, y se montaron en portaobjetos previamente tratados con3-aminopropyl-triethoxysilane (Sigma, USA). Sobre estos cortes se realizó latécnica de IHQ indirecta para la determinación in situ de TNFalfa e IL-6mediante el empleo de anticuerpos específicos disponibles comercialmente. Brevemente,los cortes se desparafinaron, rehidrataron y se realizó recuperaciónantigénica, bloqueo de la actividad de peroxidasa endógena y de las unionesinespecíficas. Luego de la incubación con el anticuerpo primario, se utilizó unkit comercial de un anticuerpo secundario biotinilado, seguido deestreptavidina-peroxidasa (Cell Marque). Finalmente, la reacción fue reveladautilizando 3,3' diaminobencidina (Dako) como cromógeno y las muestras contracoloreadascon hematoxilina. Las imágenes fueron obtenidas mediante un microscopio ÓpticoNikon Eclipse y digitalizadas mediante una cámara Nikon conectada a unacomputadora de escritorio. La evaluación de la técnica de IHQ se realizó poranálisis digital de imágenes, utilizando el sistema Image-Pro Plus 3.0.1 (MediaCybernetic), siguiendo métodos ya descritos3.La cuantificación se realizó medianteanálisis digital de imágenes (% de área marcada). Los datos obtenidos fueronevaluados mediante el programa estadístico SPSS 11.0.1 para Windows. Se realizóun análisis de la varianza de los datos obtenidos de la inmunomarcación en losdistintos tiempos de muestreo aplicando pruebas paramétricas para varios grupos(ANOVA), y como análisis posterior se aplicó el post-test de Duncan.La siguiente figura muestra laexpresión de TNFalfa e IL-6 en todas las muestras analizadas. Al respecto, se encontrarondiferencias significativas en la expresión de IL-6 en el día -21 (p < 0,05),siendo menor que en los días 7 y 21 posteriores al parto.