Diseño de sensores basados en FRET para medir hacinamiento macromolecular in vivo

MARÍA SOLEDAD LABANDA; PAULA M. COUTO; LABRIOLA, CARLOS A.; PATRICIO CRAIG; CARAMELO, JULIO J.

San Miguel de Tucumán

Congreso; III Reunión de fotobiólogos moleculares argentinos - GRAFOB del Bicentenario; 2016

Grupo Argentino de Fotobiólogos Moleculares

El interior de las células se caracteriza por presentar un alto contenido de macromoléculas, las cuales ocupan entre el 20 y el 40% del volumen total. Por exclusión estérica, esta fracción de volumen ocupado no está disponible para otras moléculas, generando importantes consecuencias termodinámicas y cinéticas sobre las reacciones que ocurren in vivo1. Esto convierte al hacinamiento molecular en un parámetro fisiológico de gran relevancia que debería ser considerado durante experimentos in vitro.El objetivo de este trabajo es desarrollar sondas que permitan medir hacinamiento molecular in vivo. Para esto diseñamos una proteína que consiste en una fusión de las proteína fluorescentes cian (CFP) y amarilla (YFP) mediante un segmento nativamente desplegado (linker) flexible. Este diseño permite que se produzca el fenómeno de FRET entre CFP y YFP al excitar la CFP2. Variando el tamaño del linker podrían obtenerse sensores que detecten distintos rangos de hacinamiento. Se generaron distintos sensores en los que se varió sistemáticamente la longitud del linker incorporando de 3 a 8 repeticiones del segmento GGSGGSGGS. Para esto se aplicó una técnica de clonado que consiste en la digestión parcial del linker por una enzima de restricción y posterior religación de los fragmentos obtenidos3. Las sondas fueron expresadas en E. Coli BL26 y purificadas por cromatografía de afinidad a metales inmovilizados y de exclusión molecular. Las proteínas purificadas fueron estudiadas por espectroscopia de fluorescencia en medios con niveles crecientes de hacinamiento, generado por PEG8000. Sus espectros muestran que la eficiencia de FRET se incrementa al aumentar la concentración de PEG8000 sugiriendo que en condiciones hacinadas los sensores adoptan conformaciones más compactas. Paralelamente se realizaron simulaciones de dinámica molecular ?de grano grueso? de una de las sondas en un medio ocupado por distintas cantidades de esferas compactas inertes simulando el crowding. El análisis de las trayectorias muestra que la distancia promedio entre cromóforos disminuye a medida que el nivel de crowding se incrementa. Esto se condice con lo observado in vitro, ya que un acercamiento de los cromóforos se traduce en una mayor eficiencia de FRET. En base a estos resultados podemos decir que, gracias a la flexibilidad del linker, las moléculas de sensor se compactan para ubicarse en los espacios libres que quedan entre las moléculas presentes en medios hacinados, donde el grado de compactación aumenta al incrementarse el nivel de hacinamiento. Los sensores se probaron in vivo analizando el cambio de hacinamiento generado en bacterias E. Coli BL26 (expresando un sensor determinado) al realizarles un shock osmótico con NaCl. Los resultados muestran que la eficiencia de FRET aumenta luego del agregado de NaCl, lo que indicaría que la respuesta al estrés osmótico va acompañada por un aumento en el nivel de crowding celular. De esta manera podrían estudiarse los cambios de crowding producidos durante otros procesos biológicos, como la respuesta a proteínas mal plegadas y la compactación de la cromatina en los núcleos de células eucariontes.Referencias1- Zimmerman S.B.,Trach S.O., J. Mol. Biol. 222, 599, 19912- Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M., Tsien R.Y., Nature, 388, 882, 1997.3- Evers T. H., van Dongen E. M. W. M, Faesen A. C., Meijer E. W., Merkx M., Biochemistry, 45, 13183, 2006.