CARACTERIZACIÓN DE LA TOXICIDAD DEL ÁCIDO EGTÁZICO EN PEZ CEBRA Y SU IMPACTO EN LA INTEGRIDAD EPITELIAL

MARTA SIAN; SAMPEDRO, MARÍA F; SIGOT, VALERIA

Encuentro; I Encuentro de Zebrafish en Red Argentina (ZebRA); 2023

El modelo de daño químico con ácido egtázico (EGTA), ha sido ampliamente utilizado in vitro. Esta molécula actúa secuestrando el calcio extracelular y desestabilizando a la cadherina epitelial (cadh-E) en las membranas, que se encuentra formando parte principalmente de las uniones adherentes (UAs). Sin embargo, no se ha descrito hasta el momento el efecto tóxico, en el modelo in vivo. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es caracterizar el efecto provocado por el EGTA, para encontrar una concentración que permita el estudio de la reversibilidad de daño en la epidermis embrionaria. Para ello se utilizaron embriones salvajes de pez cebra de 27-30 horas post fertilización (hpf). Se decorionaron, se lavaron en PBS 0,1X y se analizó el efecto para las concentraciones de 12,5 y 25 mM EGTA durante 15, 30 y 60 min a 28,5 °C. Luego se lavaron, se colocaron en medio Ringer 0,1X y evaluó el daño y el porcentaje de la sobrevida inmediatamente después del tratamiento y a las 24 horas pos-tratamiento. Esto se complementó con la marcación in vivo con nanocristales fluorescentes denominados puntos cuánticos (QDs, del inglés Quantum Dots). Los resultados mostraron que el EGTA produce daño en la epidermis en las regiones del tronco posterior y la cola, comparativamente similares entre tratamientos. Es interesante destacar que se observó un efecto de “todo o nada”, registrando embriones completamente desintegrados donde las variables de valoración no pudieron ser cuantificadas. Por otro lado, a las 24 horas pos-tratamiento, se observaron a nivel morfológico diferentes indicadores fenotípicos de los efectos tóxicos del EGTA como edemas de pericardio y/o vitelo, deformación de la columna vertebral y del saco vitelino. En cuanto al porcentaje de sobrevida de los embriones 24 h pos-tratamiento en función del tiempo de incubación, se determinó que los embriones tratados con EGTA 25 mM durante 15 min, un 74% son viables, mientras que para embriones tratados durante 30 y 60 min este porcentaje alcanza un valor estable y mínimo de sobrevida del ~50%. Por otro lado, para los embriones tratados con EGTA 12,5 mM durante 30 minutos, la sobrevida fue del ~81% y para los incubados durante 60 min, fue del 54%. Por último, el porcentaje de sobrevida de los embriones controles fue del 94%. En conclusión, a nivel fenotípico el tratamiento con EGTA en ambas concentraciones, genera daño de severidad variable a lo largo del tronco, desde la extensión del vitelo y hacia la cola. Además, el porcentaje de sobrevida a las 24 h pos-tratamiento fue similar a los 30 y 60 min para 25 mM y a los 60 min para 12,5 mM. Por lo tanto, un tratamiento con EGTA 25 mM en una exposición de 15 min podría ser suficiente para observar un efecto a nivel de las UAs en la epidermis, asegurando la sobrevida del embrión.