EFECTO DE LA PRESERVACIÓN HIPOTÉRMICA EN LA INTERNALIZACIÓN DE QUANTUM DOTS MEDIADA POR RECEPTOR EN CULTIVO PRIMARIO DE HEPATOCITOS DE RATA.

PAULA HOVANYECZ; VALERIA SIGOT; JOSÉ MANUEL PELLEGRINO; JOAQUÍN VALENTÍN RODRIGUEZ; EDGARDO ELVIO GUIBERT

Jornada; V Jornadas de Ciencia y Tecnología; 2011

El transporte endocítico mediado por receptores requiere la integridad de las membranas celulares y del citoesqueleto para la activación e internalización de complejos ligando-receptor. La preservación hipotérmica de células (PH) y la posterior reoxigenación normotérmica (RN), etapas previas a la aplicación en trasplante celular, generan severos daños dependientes del tiempo y condiciones de preservación en frío. En el presente trabajo se propuso evaluar esta injuria en el citoesqueleto, precisamente en los filamentos de actina, y en la membrana plasmática y su efecto en el transporte endocítico mediado por receptor. El modelo de estudio fueron hepatocitos de rata en cultivo primario (HC) y preservados (HP) durante 24 y 72 hs a 4°C en solución de la Universidad de Wisconsin. Con el objeto de monitorear el transporte endocítico se utilizaron nanopartículas fluorescentes, Quantum Dots (QDs) conjugadas al ligando factor de crecimiento epidérmico (EGF) y se siguió la internalización del complejo EGF-QD mediada por el receptor EGFR. Los complejos preformados se incubaron con los HC y HP post-preservación y se evaluó la unión a la membrana plasmática e internalización luego de 30 y 120 minutos de incubación a 37°C en atmósfera de 5% CO2 (RN), mediante microscopía confocal de fluorescencia. Para la determinación de las alteraciones producidas en los filamentos de actina se utilizó Phalloidin-Alexa 633, una toxina fluorescente que se une específicamente a polímeros de actina, permitiendo su análisis mediante microscopía de fluorescencia. La viabilidad funcional de las células se determinó analizando la liberación de lactato dehidrogenasa (LDH). Esta última es una enzima citosólica y su liberación al medio extracelular es señal de deterioro en la membrana plasmática. Los resultados obtenidos por las técnicas antes mencionadas indicarían que cuando las células son preservan por 24 hs (HP24) con y sin RN, las membranas mantienen una integridad similar a los controles HC, con valores de liberación de LDH menores al 10%. La distribución de los filamentos de actina se mantiene sin alteraciones en los HP24 al comparar las células con y sin RN. Los complejos EGF-QDs se unen a la membrana y son internalizados en ambos grupos experimentales, tal y como lo hacen los HC. Se compararon estos resultados con los obtenidos luego de 72 hs de preservación (HP72). Previo a la RN los HP72 presentan valores de liberación de LDH comparables a los HP24, sin embargo luego de la RN, los HP72 exhiben hasta un 90% de liberación de la enzima, indicando que la membrana sufre un deterioro notable. En los HP72, la tinción de actina presenta menor intensidad, que podría estar ligada a una despolimerización de los filamentos, evidenciándose también un cambio en la distribución de los mismos. Luego de 72 h de preservación los complejos EGF-QDs se unen a la membrana plasmática pero los mismos son incapaces de ser internalizados mientras transcurre la RN, pudiendo atribuirse esto a la despolimerización de los filamentos de actina o al daño producido en la membrana plasmática mientras transcurre la RN. Estas observaciones permiten aseverar que 24 hs de PH y posterior RN no alteran la internalización del complejo EGF-QD, mientras al someter a las células a 72 hs de almacenamiento en frío sí se produce una modificación de la capacidad funcional de los hepatocitos. Esto debería ser tenido en cuanta en  protocolos de aplicación del transplante hepatocelular.