Liberación dirigida de liposomas biotinilados marcados interna y superficialmente con Quantum Dots

VALERIA SIGOT; THOMAS JOVIN

Rosario

Jornada; III Jornadas de Ciencia y Tecnología; 2009

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (en inglés, EGFR) se sobre-expresa en células tumorales en mama e hígado, entre otros, con lo cual constituye un receptor muy atractivo para blanco de terapias anticancer dirigidas empleando liposomas. En este trabajo se desarrolló un sistema compuesto por Partículas Lipídicas Biotiniladas (PLBs) en las que se encapsularon nanocristales fluorescentes conocidos como puntos cuánticos (en ingles, Quantum Dots, QDs) para ser dirigidas específicamente a células que expresen el EGFR. Se ha demostrado previamente que el complejo preformado del ligando EGF y QDs se une y activa específicamente al EGFR, dando lugar a un secuencia de eventos que incluye la internalización del complejo mediante endocitosis. Por lo tanto, para dirigir e internalizar específicamente las PLBs se modificó la superficie de las mismas con complejos preformados de EGF-QDs. Las PLBs se prepararon empleando una técnica de diálisis de detergente que permitió encapsular de 2 a 5 QD655 (emisión de fluorescencia a 655 nm) en partículas de 100-130 nm de diámetro. Las PLBs-QD655 fueron luego purificadas y caracterizadas mediante dispersión dinámica de luz, microscopía atómica y electrónica. Luego, las PLBs-QD655 fueron conjugadas superficialmente a complejos preformados del EGF y QD525 (emission de fluorescencia a 525 nm), EGF-QD525. La estrategia de doble marca fluorescente interna y superficial se diseñó para monitorear en tiempo real las PLBs y su contenido mediante microscopía confocal de fluorescencia, luego de incubarlas con células de la línea A431 que sobre-expresan el EGFR. Se comparó entonces la internalización de PLBs dirigidas (EGF-QD525-PLBs-QD655), y no dirigidas PLBs-QD655, luego de incubarlas con las células A431 durante 10, 30 y 60 minutos a 37°C. Luego, se monitoreó la unión e internalización visualizando la fluorescencia de los QD655 y QD525 simultáneamente y en tiempo real. Observamos que sólo las partículas dirigidas fueron internalizadas por las células mientras que no se observó unión a las membranas de las PLBs-QD655 en las condiciones probadas. Una vez internalizados, los QDs 655 y QD525 se mantuvieron colocalizados en regiones perinucleares. Para demostrar la especificidad por el EGFR se realizó un ensayo de competición en presencia de un exceso de ligando EGF libre y se observó una completa inhibición de la unión de PLBs dirigidas. Adicionalmente se condujeron experimentos similares, incubando las PLBs dirigidas con células que no expresan el EGFR y no se observó internalización de los complejos dirigidos. Estas observaciones indicaron que la endocitosis fue mediada por el EGFR. Las propiedades de fluorescencia de los QDs muy superiores a las de los fluoróforos orgánicos convencionales permitieron una visualización por períodos mayores a 30 minutos sin pérdida evidente de la fluorescencia. El sistema se presenta como una buena plataforma para encapsular una droga con fines terapéuticos dirigida específicamente a células que expresan el EGFR y visualizar la entrada y destino final intracelular. Actualmente, se está desarrollando en el CAIC una aplicación del sistema que pueda permitir monitorear mecanismos de endocitosis mediada por receptor en células preservadas previamente a bajas temperaturas con potencial aplicación a transplante.