Purificación e identificación de péptidos de amaranto con actividad citomoduladora in vitro.

BARRIO DANIEL; QUIROGA ALEJANDRA V.,; AÑÓN, M. CRISTINA

Congreso; XIII Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de los Alimentos; 2011

En los últimos años se ha hecho énfasis en el estudio de alimentos que promueven efectos saludables sobre el hombre. En este sentido, las proteínas de reserva de las semillas de amaranto se presentan como una fuente potencial de péptidos con función biológica de importancia para la salud del consumidor. Con el objetivo de purificar, caracterizar e identificar los péptidos con actividad citomoduladora presentes en un aislado proteico de amaranto (APA) se obtuvo una fracción proteica con DMSO-agua al 50%. La inhibición de la proliferación de células tumorales y los efectos citotóxicos (actividad mitocondrial y lisosomal) de las fracciones proteicas liofilizadas y resuspendidas en medio de cultio (DMEM) se evaluaron utilizando células tumorales UMR106 y captación de colorantes específicos por las mitocondrias (colorante de tetrazolio: MTT) y lisosomas (Rojo Neutro: RN). La fracción más activa fue analizada por electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). Posteriormente se separó por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC). Las subfracciones obtenidas se analizaron por electroforesis (Tricina-SDS-PAGE), los polipéptidos presentes se separaron mediante electroforesis bidimensional (IEF-Tricina-SDS-PAGE), se sometieron a hidrólisis tríptica y se analizaron mediante MALDI-MS y LC-ESI-MS/MS. A partir de curvas dosis respuesta se calculó por el método de Probit la concentración en mg/ml que inhibe el 50 % de la proliferación celular (IC50) con un nivel de confianza del 95 %. La fracción de polipéptidos solubles en 50 % de DMSO fue diez veces más activa que el APA (IC50: 0,1 ± 0,02 vs 1± 0,15 mg/ml). A partir de la separación de esta fracción por RP-HPLC se obtuvieron 5 picos de los cuales el más hidrofóbico mostró mayor actividad antiproliferativa (IC50: 0,02 ± 0,005 mg/ml). Por otro lado, la fracción más activa mostró efectos citotóxicos (actividad lisosomal y mitocondrial) en forma dosis respuesta. La concentración que inhibió el 50 % de la captación del colorante específico fue: 0,02 ± 0,006 y 0,03 ± 0,004 mg/ml para MTT y RN, respectivamente. La fracción extraída con DMSO 50% contenía principalmente polipéptidos de masa molecular aproximada 30 kDa. Las subfracciones obtenidas a partir de la separación por RP-HPLC fueron similares en cuanto a su composición polipeptídica. El pico más hidrofóbico estaba formado por polipéptidos de masa molecular de 30 kDa y 20 kDa; también se observaron algunos de mayor tamaño que no son bien resueltos con esta técnica. A partir de los geles bidimensionales IEF-tricina-SDS-PAGE se seleccionaron las bandas más abundantes (una correspondiente a 30 kDa y otra a 20 kDa) para su hidrólisis con tripsina y posterior análisis por MALDI. Se encontraron dos péptidos potencialmente responsables de la actividad citomoduladora ILDPLAQFEVEPSK y LSTDDWILVDGNDPR que pertenecen a la fracción lectina de amaranto. La purificación de esta fracción proteica y su utilización como ingrediente alimentario abre interesantes posibilidades para el desarrollo de nuevos alimentos funcionales.