Dendrímeros como nanonaves de siRNA

ANA PAULA PEREZ; MARIA JOSE MORILLA; EDER LILIA ROMERO

Bernal

Workshop; Nanomedicinas en Latinoamérica; 2006

Programa de Nanomedicias-Universidad Nacional de Quilmes

El uso de RNA pequeño de interferencia (siRNA) como terapia silenciadora de genes aún no es ampliamente utilizada in vivo debido la incapacidad de lograr que estas moléculas accedan selectiva y eficientemente in vivo a las células y órganos blanco. El acceso correcto en tiempo y forma a un blanco intracelular desde la vía sistémica esta obstaculizado por barreras anatomo-fisiológicas extracelulares e intracelulares. En los últimos años se han elaborado diferentes estrategias para sortear estas barreras y lograr el acceso in vivo de los siRNAs con resultados variables.1-2 Los dendrímeros son nanopolímeros tridimensionales formados por un core central y una superficie ramificada. Existen diferentes familias de acuerdo a su composición, los dendrímeros PAMAM son polímeros de poliamidoamina, con un core de etilendiamina. Los dendrímeros son nanoSistema de Entrega de Drogas (nanoSED) único, ya que poseen mínima polidispersidad, número de grupos superficiales estrictamente definido, y su tamaño comprendido en el rango de las unidades de nanometros. Además, son extremadamente solubles y estructuralmente estables en medios acuosos. Debido a estas características y a su carga superficial positiva son potenciales nano-CRS de ácidos nucleicos.3-4 Se estudió la formación de complejos dendrímero-siRNA estables a partir de la combinación de dendrimeros PAMAM de generación cuatro (G4) y siRNA anti-proteína fluorescente verde (GFP) en distintas relaciones de carga +/-, (G4/siRNA) (1/1, 5/1, 10/1 y 20/1) en buffer Tris pH 7,5 bajo agitación.  La complejación se estudió por desplazamiento de bromuro de etidio unido a siRNA, a partir de la interacción con dendrímeros (Fig 1), se observó que cuando la relación de cargas es 1/5 se alcanza un equilibrio del sistema, ya que se desplaza la mayor cantidad del fluoróforo. Por retardo electroforético en gel de poliacrilamida 20%, se verificó la formación de complejo a partir de la relación 1/5 y se evidenció su desensamblaje en presencia SDS (detergente iónico). El tamaño de los complejos esta en el rango nanométrico y se midió por dinamic light scattering. La citotoxicidad de los complejos luego de 24 hs de incubación, se estudió por el método de MTT en función de la concentración de siRNA y de la relación +/-. Se utilizaron células Vero, (fibroblastos) que endocitan sustancias del medio y células J774 (macrófagos) con capacidad de fagocitar partículas. En ambas líneas celulares, a concentraciones de 50 y 100 nM de siRNA, la viabilidad disminuyó hasta un máximo de 45% al aumentar la relación de carga +/-, lo que implica un aumento en la concentración de los dendrímeros hasta 1.20 µM. Mientras que a 200nM de siRNA la viabilidad disminuyó alrededor de 30% en la mayoría de las relaciones +/-, sólo en las células J774, en presencia de la mayor concentración de dendrímeros, el porcentaje de viabilidad disminuyó  55%.