Preparación y caracterización de nanovesiculas triplemente dirigidas: SR-A1, TLR-3 y TLR-7

YASYNSKA, OLENA; PEREZ, ANA PAULA; ROMERO, EDER LILIA

Encuentro; NANO 2022 ENCUENTRO DE SUPERFICIES Y MATERIALES NANOESTRUCTURADOS; 2022

Actualmente se reconoce que la inmunidad innata es clave para controlar y aumentar la respuestainmune adaptativa. Uno de los principales mecanismos de activación del sistema inmune innato consiste enla activación de receptores de reconocimiento de patrones (RRPs) por motivos microbianosestructuralmente conservados, como son los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Entre losRRPs encontramos al grupo de los Toll-like receptors (TLRs) que son proteínas transmembrana localizadas enla superficie extracelular y compartimientos endosomales que reconocen distintas clases de ácidos nucleicosbacterianos, virales y endógenos. Se sabe que distintos agonistas de TLR evocan potentes reacciones deinmunidad adquirida celular, por lo que se los emplea como adyuvantes de vacunas o monoterapia.Sin embargo, la administración parenteral de agonistas de TLR pueden causar reacciones tipo shockséptico letales y contribuir a la disfunción de órganos remotos, no relacionados físicamente con el área atratar. Este es el caso de la molécula imiquimod (IMQ) –ligando de TLR 7-, la cual requiere de estrategias queimpidan su escape del sitio de administración. Asimismo, elevadas dosis parenterales de PolyIC –ligando deTLR3- causan fiebre y anemia, siendo éste proclive a degradarse rápidamente por ribonucleasas ubicuas enplasma y tejidos.En nuestro trabajo, proponemos incorporar IMQ y PolyIC en nanovesiculas arqueolipídicas(NanoARQC), que se sabe, son reconocidas por receptores Scavenger-A1 (SR-A1), lo que conduce a suextensiva internalización por células blanco y luego a un delivery masivo a endosomas. Mediante estaestrategia, esperamos obtener sinergia en la activación simultánea de TLR3 y 7, magnificando así suadyuvancia y a la vez confinándola sitio-específicamente.En primer lugar, se prepararon y caracterizaron estructuralmente complejos de IMQ y PolyIC.Espectros de fluorescencia demostraron que PolyIC actúa como quencher de IMQ. Asimismo, medianteensayos de desplazamiento de naranja de acridina y el cálculo de K binding mediante la ecuación deConnors, que fue igual a 11267 ± 6021 M-1, encontramos que hay interacción espontánea entre las basesnitrogenadas de PolyIC e IMQ, formándose entre ambos un complejo de intercalación. Luego, se logró ponera punto la preparación de NanoARQC que mantuvo intacta la estructura de PolyIC y presentó un Z averagede 502 ± 175 nm. Tras 24 h de incubación de NanoARQC con macrófagos humanos THP-1 hallamos queconcentraciones de 100 µg/ml de fosfolípidos, 5 µg/ml de IMQ y 10 µg/ml de PolyIC resultaron no sercitotóxicas e indujeron una significativa liberación de TNF-α respecto a IMQ y PolyIC libres.En conclusión, logramos reducir la repulsión electrostática entre polianiones (PolyIC) y superficies deelevado potencial Z negativo (nanovesiculas arqueolipídicas), combinando PolyIC e IMQ en una únicananopartícula lo suficientemente pequeña como para ser endocitada y capaz de inducir una pronunciadaliberación de TNF-α en macrófagos.