La terapia génica con IGF1 dirigida a astrocitos hipocampales por virus adeno-asociados bicistrónicos astrocito-selectivos previene el deterioro mnemónico y comportamental en un modelo de Enfermedad de Alzherimer esporádica en rata

FACUNDO PERALTA; ANA ABRIL VIDAL ESCOBEDO; JULIETTE LÓPEZ HANOTTE; PAULA CECILIA REGGIANI; JOAQUIN PARDO

La Plata

Congreso; Jornada de Investigación 2022. FCM. UNLP; 2022

Introducción: La Enfermedad de Alzheimer esporádica (EAe) es la enfermedad neurodegenerativa más prevalente, aún sin cura. Esto la convierte en una problemática con costos económicos, sociales y familiares muy altos, lo que la ha puesto en el foco de interés del ámbito científico durante décadas. El estudio histopatológico cerebral muestra que el hipocampo (Hc) se encuentra gravemente afectado y presenta una marcada reactividad astroglial. Previamente hemos estudiado un modelo de EAe en rata, generado por la inyección intracerebroventricular (icv) de estreptozotocina (STZ), y observamos que los animales muestran deterioro comportamental e histopatológico característicos de la enfermedad. Precisamente hemos estudiado la vulnerabilidad de los astrocitos en este modelo, revelada por cambios morfológicos y un aumento en los niveles de proteína ácida fibrilar glial (GFAP). En este contexto, nos propusimos desarrollar terapias dirigidas a astrocitos que anulen las acciones perjudiciales de los astrocitos reactivos, potencien sus acciones neuro y glioprotectoras, y restablezcan o aumenten sus propiedades homeostáticas, moduladoras y defensivas.Objetivos: 1)- Construir y caracterizar la expresión génica recombinante de un vector viral adeno-asociado (AAV) bicistrónico que sobreexpresa un potente factor neurotrófico, el factor de crecimiento símil insulina 1 (IGF1), seguido de la proteína fluorescente roja tdTomato (gen marcador que permite observar las células transducidas) solamente en astrocitos. Además, generar el AAV control que sobreexprese la proteína fluorescente verde (GFP), en lugar del IGF1, en astrocitos. 2)- Implementar terapia génica (TG) preventiva con IGF1 en astrocitos hipocampales del modelo de EAe y evaluar el impacto de la modulación astrocítica sobre el comportamiento y la memoria de los animales.Materiales y métodos: •Generación de AAV: AAV de serotipo 9 bicistrónicos impulsados por el promotor gfaABC1D (específico para células GFAP+) se generaron mediante el sistema de 3 plásmidos. Los plásmidos para cápside 9, pHelper y de transferencia construidos por nosotros, portadores de los casetes gfaABC1D-IGF1-ires-tdTomato y gfaABC1D-GFP-ires-tdTomato se transfectaron en células HEK293, 4 días después, los AAV generados se purificaron y titularon por qPCR dirigida a repeticiones terminales invertidas. La caracterización de los AAV se realizó por RT-qPCR e inmunohisquímica (IHQ): Se realizaron inyecciones intrahipocampales de ambos AAV y 3 semanas después, se fijaron algunos cerebros para realizar IHQ mientras que desde el resto se disecaron los hipocampos para extracción de ARN y análisis de expresión génica por RT-qPCR. •Terapia génica preventiva con IGF1 en astrocitos hipocampales del modelo de EAe: Se utilizaron ratas macho jóvenes que se dividieron en 3 grupos: SHAM (n=7), GFP (n=5) e IGF1 (n=4). En el Día experimental (DE) -28 los animales recibieron inyecciones bilaterales de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) (grupo SHAM) o AAV-GFP/IGF1 (grupos GFP e IGF1). En el DE 0, los animales recibieron bilateralmente icv LCRa (SHAM) o STZ (3mg/kg) (grupos GFP e IGF1). Entre los DE +17/+26 se realizaron test comportamentales para evaluar el comportamiento típico de especie, la memoria de reconocimiento de objeto nuevo, la memoria espacial y el comportamiento símil depresión. Luego, en el DE +27 se realizó el sacrificio de los animales. Resultados: Se generaron los AAV-IGF1 y AAV-GFP, y se confirmó la correcta expresión de los transgenes mediante RT-qPCR y por IHQ. Se determinó la alta especificidad de los vectores para expresar los transgenes en astrocitos dado que el 100% de las células GFAP+ expresaron fluorescencia roja (tdTomato+). Además, observamos que una sola inyección del vector es suficiente para transducir el Hc en toda su extensión rostro-caudal, demostrando que estos AAV constituyen una tecnología eficiente, simple, y única para sobreexpresar dos genes en astrocitos hipocampales mediante una sola inyección. En el estudio de TG con IGF1 en astrocitos hipocampales se observó que los animales que recibieron el AAV-GFP+STZ mostraron un significativo deterioro (P