Estudios de resonancia paramagnética electrónica de dominios de membrana de eritrocitos humanos resistentes a la extracción con tritón X-100.

M.G. RIVAS; A.M. GENNARO

Santa Fe (Argentina)

Congreso; XXIV Congreso Argentino de Química.; 2002

Los rafts lipídicos son microdominios segregados lateralmente en las membranas celulares enriquecidos en colesterol, esfingolípidos y proteínas ancladas a GPI. Estos dominios, llamados también DRMs (Detergent Resistant Membranes), son resistentes a la extracción en frío con detergentes no iónicos. Se ha demostrado que están implicados en una variedad de procesos de señalización celular. Recientemente se ha reportado el hallazgo de DRMs en la membrana de eritrocitos. El método usual para aislar estructuras de DRMs es someter el extracto insoluble a detergente a ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa, después del cual se encuentran proteínas características de DRMs flotando en una zona de baja densidad, debido a su asociación con estructuras lipídicas. En este trabajo proponemos un método simple para detectar y analizar DRMs mediante EPR (espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica) utilizando los marcadores de espín liposolubles 5-, 12- y 16- doxil-ácido esteárico. El parámetro de orden evaluado por espectroscopía de EPR muestra valores sistemáticamente mayores en DRMs en comparación con la membrana intacta del eritrocito, lo que indica un mayor empaquetamiento de las cadenas acílicas (es decir, mayor orden) a las distintas profundidades evaluadas. Estos resultados son consistentes con el mayor contenido de colesterol relativo de estas estructuras en comparación con la membrana del eritrocito intacta. Hemos encontrado además que en eritrocitos con niveles de colesterol reducidos estas estructuras lipídicas permanecen luego del tratamiento con Tritón X-100. Estos DRMs fueron tambien analizados por EPR, y sus parámetros de orden no mostraron cambios significativos en comparación con los DRMs de células con contenido de colesterol normal. Algunos autores afirman que los DRMs de eritrocitos se destruyen si se reduce la concentración de colesterol en la membrana en aprox. un 40% previamente a la extracción con detergente. La evidencia en la que basan esta afirmación es que en este caso no aparecen proteínas en la región menos densa del gradiente de sacarosa. Sin embargo, nuestros resultados indican que la matriz lipídica de los DRMs se conserva luego de la reducción de colesterol. Po lo tanto, la destrucción de rafts reportada por otros autores se limita a la solubilización de proteínas sin desaparición de la matriz lipídica. Sorprendentemente, los DRMs obtenidos luego de la reducción de colesterol no muestran una disminución significativa en el orden de las cadenas acílicas cuando se los compara con los DRM de membranas intactas. Actualmente estamos trabajando sobre estos resultados.