Análisis proteómico comparativo de de dos cepas de Pseudomonas aeruginosa con diferente capacidad de adhesión a superficies celulares mediante 2D DIGE MALDI TOF TOF

JÉSSICA ROSSELLO; ANALÍA LIMA; ARLINET KIERBEL; ROSARIO DURÁN

Congreso; 3er Congreso Uruguayo de Química Analítica; 2014

Introducción: Pseudomonas aeruginosa (PA) es un patógeno oportunista capaz de causar la muerte a individuos inmunocomprometidos. Representa un problema importante a nivel de la salud, ya que es el 3er o 4to aislamiento hospitalario más común [1]. Constituye la principal causa de muerte en individuos con Fibrosis Quística, siendo la formación de biofilms un factor clave en la resistencia a antibióticos y la cronicidad de la infección [2]. La transición desde una forma de vida planctónica a una asociada a superficie, es un paso temprano crucial en la formación de biofilms y el establecimiento del proceso infectivo. En este sentido, nuestro grupo de trabajo ha demostrado que una cepa de PA que sobre-expresa una fosfodiesterasa específica que degrada al segundo mensajero c-di-GMP, es incapaz de adherirse a la superficie celular. A partir de estos resultados nos propusimos estudiar las bases moleculares de la adhesión de PA sobre la superficie celular. Objetivo: Determinar diferencias a nivel de proteínas secretadas y de membrana entre dos cepas de PA con distinta capacidad de adhesión a superficies celulares. Metodología: Para llevar a cabo el objetivo se utilizó la técnica de proteómica cuantitativa 2D DIGE (two dimensional difference gel electrophoresis). Esta tecnología permite comparar distintas condiciones biológicas en forma cuantitativa a partir de un análisis proteómico, utilizando la espectrometría de masa como herramienta de identificación. Brevemente, se marcaron las proteínas de ambas cepas de PA con dos fluoróforos distintos(Cy3 & Cy5) se mezclaron y separaron en un mismo gel 2D junto a un estándar consistente en una mezcla equimolar de ambas muestras marcada con un tercer fluoróforo (Cy2). Los geles fueron analizados con un sistema de adquisición de imágenes/software (Typhoon FLA-9500/ DeCyder 2D, GE) que detecta diferencias en la abundancia relativa de proteínas en forma precisa. La identidad de las proteínas diferencialmente expresadas se determinó mediante espectrometría de masas de tipo MALDI TOF-TOF. La tecnología de 2D-DIGE minimiza el problema de variabilidad entre los geles, disminuye el tiempo de análisis y permite una cuantificación y comparación más precisa y sensible de los perfiles de expresión proteica. Resultados y conclusiones: Como resultado de la aplicación de la tecnología de 2D DIGE / MALDI TOF- TOF a nuestro problema planteado se generó una lista de candidatos implicados en la adhesión de PA a la superficie celular. Recientemente, algunos de estos candidatos proteicos han sido biológicamente validados por nuestro grupo de trabajo. Algunas de éstas proteínas podrían representar buenos candidatos como blancos para la intervención terapéutica. La búsqueda de estrategias alternativas, que apunten no sólo a eliminar a la bacteria planctónica, sino a evitar la formación de biofilms son hoy en día de gran interés, debido a la barrera que éstos imponen frente al tratamiento con antibióticos Referencias: [1] K. Todard, Todard?s online textbook of bacteriology (2008). Disponible en www.textbookofbacteriology.net [2] Mandell GL, Bennett JE & Dolin R. Principles and Practice of Infectious Diseases. New York, Churchill Livingstone Inc. (2000) 4320p.