Aplicación de micobacteriófagos para la detección de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.

MOYANO R. D.; MON ML; SANTANGELO MP; PIURI M.; ROMANO M.

Rosario

Congreso; VIII SLAMTB MEETING; 2016

Sociedad Latinoamericana de tuberculosis y otras micobacterias

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) es el agente causal de la Paratuberculosis, una enteritis granulomatosa crónica que afecta principalmente bovinos y es altamente prevalente en Argentina. El método de diagnóstico ?gold standard? de esta enfermedad es el cultivo a partir de materia fecal. Actualmente se utilizan métodos de detección de micobacterias mediante fagos que contienen un gen reportero fluorescente el cual es detectado fácilmente mediante microscopia de epifluorescencia, fluorímetro de placas o por citometría de flujo.El objetivo de este estudio es evaluar la detección de MAP viable utilizando micobacteriófagos, con el fin de obtener un diagnóstico rápido en comparación con los tiempos de crecimiento del cultivo.Para ello se infectó un cultivo de la cepa de MAP de referencia (K10) y muestras pertenecientes a rodeos infectados (materia fecal y leche) con un micobacteriófago que contiene el gen de una proteína fluorescente roja, Cherry Bomb, para detectar micobacterias viablesmediante microscopia de epifluorescencia.Para evaluar la capacidad infectiva del fago, se infectó K10 a partir de cultivo con 100 µl de solución stock de fago 1x108/ml.Luego la capacidad infectiva del micobacteriófago fue evaluada en muestras de materia fecal. Se realizó la dilución de 1gramo de materia fecal en 15 ml de PBS, tomando 500 µl del sobrenadante, el cual fue infectado con igual concentración de solución del micobacteriófago. Por otro lado, la infectividad del mismo fue evaluada en las mismas condiciones en muestras de leche utilizando 50 ml, la cual fue centrifugada resuspendiendo el pellet en 15 ml de PBS e infectando 500 µl del sobrenadante. Las diferentes muestras fueron incubadas 6 horas a 37°C y fijadas con paraformaldehido 2%. El mismo protocolo fue utilizado para los controles con muestras de animales sanos (negativos).Como resultado de los ensayos realizados se observó que los fagos infectan y permiten la detección de MAP evidenciada por microscopia de epifluorescencia a partir de cultivo y materia fecal. Por otro lado, no pudo observarse fluorescencia en las muestras de leche, posiblemente sea necesario optimizar las condiciones de infección. Estos resultados nos sugieren seguir evaluando este método como un posible diagnóstico de MAP viables de forma rápida y sensible.