EVALUACIÓN DE LA SOBREVIDA DE Mycobacterium avium Y DIFERENTES AISLAMIENTOS LOCALES DE Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis EN LA LÍNEA CELULAR J774

COLOMBATTI OLIVIERI, MA; VIALE, M; MOYANO, D; MON, ML; MONTENEGRO, V.; GIOFFRE, A.; TRAVERIA, G.; SANTANGELO, P.; DELGADO, F.; ROMANO, M.

Capital Federal

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología y II Congreso Microbiología Agrícola y Ambiental 2013; 2013

AAM (Asociacion argentina de microbiologia)

La paratuberculosis, causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), es una enfermedad de los rumiantes de importancia económica y distribución mundial. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la sobrevida de Mycobacterium avium subsp. avium (Maa) y 6 diferentes aislamientos locales de Map en macrófagos murinos, con el fin de identificar una cepa local atenuada que podrá usarse en un futuro como vacuna contra paratuberculosis. Se crecieron los aislamientos locales de Map (6613, 1347/498, 6611, A162, 1543/481 y 2405/2011) y la cepa D4ER de Maa en caldo Middlebrook 7H9 (enriquecido con OADC, glicerol, Tween 80 y Micobactina para el caso de Map) a 37°C durante 1-2 semanas (Maa) y 12-16 semanas (Map). El inoculo se preparó con una alícuota del cultivo, previa eliminación de los grumos bacterianos por pasaje en aguja 25G y filtro 5µm. Se infectó con una multiplicidad de infección (MOI) de 5:1 a la línea de macrófagos murinos J774, pre-estimulados por 24hs con 0.5ng/ml de IFN-γ  en placas de 24wells, con 1 x 105 células/well en medio RPMI con 2% SFB inactivado (colocando cubreobjetos en algunos pocillos). Tras 4hs de incubación se eliminaron las bacterias no fagocitadas mediante el agregado de 50µg/ml de gentamicina (2hs) y lavados. En este momento (tiempo 0) y a los 2 y 4 días post-infección (dpi) se utilizaron 3 técnicas para evaluar sobrevida, las dos primeras lisando los macrófagos con Triton X-100 al 0.1%.: a-Bacteriológico: sembrando diluciones en agar Middlebrook 7H10 enriquecido; b-Colorimétrico: recuento en cámara de Neubauer con el sistema ?Live/dead Baclight?(R)- Invitrogen (diferencia microorganismos viables de no viables); y c-Tinción Ziehl Nielsen modificado (según Ellis & Zabrowarny), en los pocillos que contenían los cubreobjetos, los cuales fueron fijados (paraformaldehido 4% 20 min) y teñidos. Se determinaron la proporción de macrófagos infectados (contando un mínimo de 100 macrófagos por well) y el índice fagocitario. Se utilizaron como control negativo wells sin infectar. Por la técnica de recuento en placa la sobrevida de Maa fue menor que la mayoría de las cepas de Map. El aislamiento 1347/498 fue el de menor sobrevida, siendo la misma similar a la de Maa. Map 2405/2011 fue el de mayor sobrevida, junto con la cepas 6613 y 6611 (pero estas dos últimas tuvieron alto desvio estándar). Las cepas restantes tuvieron una sobrevida intermedia. La determinación de micobacterias viables mediante la técnica colorimétrica evita el prolongado tiempo de desarrollo de Map en cultivo, sin embargo los restos celulares del lisado de macrófagos interfieren con el recuento de las bacterias. El método ZN permitió estimar la sobrevida de las bacterias a través del recuento de bacterias intracelulares, además de permitir la observación de la morfología de los macrófagos, pudiendo detectar algunos con alteraciones compatibles con apoptosis.