Análisis cuantitativo de neuromoduladores de la ingesta en larvas triploides de Rhamdia quelen y sus variaciones en un esquema de ayuno realimentación

GUARAGNA, G.; MASCAMBRONI, M.B.; MENDÍA, A.C.; BOAGLIO, A.C.; MUÑOZ, L.; VIGLIANO, F.A.

Zavalla-Casilda

Jornada; XX Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas, Facultad de Ciencias Veterinarias. VII Jornada Latinoamericana. V Jornadas de Ciencia y Tecnología, Facultad de Ciencias Agrarias. IV Reunión Transdisciplinaria en Ciencias Agropecuarias; 2019

Facultad de Ciencias Agrarias y Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR

El bagre sudamericano (Rhamdia quelen) es una especie ampliamente distribuida en América del sur. Presenta hábitos omnívoros, rápido crecimiento y su rusticidad hace que se adapte muy bien a nuestra zona para cultivos intensivos o semi intensivos. No obstante, el rápido crecimiento trae aparejado una pronta madurez sexual. Esto determina que durante el período reproductivo las reservas energéticas sean destinadas a la maduración sexual en detrimento del crecimiento somático. Actualmente entre las diferentes herramientas biotecnológicas utilizadas para optimizar la producción se destaca la triploidización por choque térmico, que permite la obtención de individuos estériles. Trabajos de nuestro grupo de investigación demostraron que los individuos triploides de R. quelen poseen un mayor peso final de faena y mayor rendimiento de carcasa en comparación con sus hermanos diploides3. Otra técnica muy utilizada es el manejo de períodos de ayuno y realimentación. Así, en individuos sometidos a un período de ayuno, se observa un crecimiento acelerado debido a la hiperfagia compensatoria, síntesis proteica y respuestas hormonales al reestablecerse la alimentación. Dentro del complejo sistema de control de la alimentación en peces, el sistema neuroendocrino difuso (SNED) cumple importantes funciones. El SNED está conformado por células enteroendócrinas localizadas en la mucosa digestiva que producen y secretan neuropéptidos moduladores de la ingesta. Entre estos destacan dos con funciones antagónicas: el neuropéptido Y (NPY) y la colecistoquinina-8 (CCK-8) con funciones orexigénicas y anorexigénicas, respectivamente. Además de expresarse en el SNC, ambos se inmunolocalizan en la mucosa intestinal. Teniendo en cuenta que la larvicultura es la etapa de cultivo donde se desarrollan los órganos relacionados con la ingesta y las células enteroendócrinas, el presente trabajo tuvo por objetivo evaluar los efectos del nivel de ploidía y el ayuno con posterior realimentación en la expresión de NPY y CCK-8 en células neuroendocrinas intestinales de larvas de R. quelen.Las larvas diploides y triploides se obtuvieron siguiendo el protocolo experimental descrito por nuestro grupo de trabajo3. A los 21 días post-eclosión, se sometieron larvas de ambos grupos (diploides y triploides) a un ayuno de 30 horas de duración. El resto de las larvas diploides y triploides fueron alimentadas con la frecuencia habitual, sirviendo como grupos controles alimentados. Luego de las 30 horas de ayuno se tomaron muestras de individuos diploides y triploides ayunados (grupos DA0 y TA0) y alimentados (grupos DC y TC). Posteriormente, los peces fueron realimentados y se tomaron muestras de larvas diploides y triploides tras 1 (grupos DA1 y TA1) y 3 (grupos DA3 y TA3) horas, quedando así constituidos los ocho grupos experimentales (Fig. 1). Se muestrearon 15 larvas por grupo. Las muestras se procesaron de manera rutinaria para su inclusión en parafina, y se realizaron cortes histológicos, los cuales fueron recolectados en portaobjetos silanizados. Utilizamos una técnica inmunohistoquímica indirecta de acuerdo al protocolo descripto por nuestro grupo de investigación para la especie1. Se utilizaron anticuerpos primarios policlonales anti-NPY (1:1500; Laboratorios Península, T-4454) y anti-CCK (1:1000; Laboratorios Península, T-4254), y anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo conjugado con moléculas de dextrano y peroxidasa (Immpress®, Laboratorios Vector, MP-7801). Una vez obtenidos los cortes inmunomarcados y contrastados, se utilizó un fotomicroscopio Leica DM750 equipado con una cámara Leica EC3 para obtener 10 imágenes de intestino ascendente por cada larva. Se utilizó el software de distribución gratuita ImageJ (v. 1.52a) para cuantificar la cantidad de células inmunopositivas a NPY y CCK por mm-2 de mucosa intestinal. Los datos se analizaron con test de ANOVA a dos criterios para determinar la interacción entre factores (nivel de ploidía y estado nutricional). Posteriormente, se evaluaron las diferencias entre ejemplares con distintos estatus nutricionales diploides o triploides mediante ANOVA a un criterio de clasificación con postest de Tukey. Las diferencias entre diploides y triploides de una misma condición nutricional se analizaron mediante test t de student. Cuando los datos no pasaron el test de normalidad se utilizaron métodos no paramétricos. Para el análisis se empleó el software estadístico JMP (v. 5.1.1) considerando diferencias significativas a p < 0,05.Al analizar los datos con un ANOVA a dos criterios las variaciones en la inmunorreactividad a CCK-8 en diploides y triploides con distinta condición alimentaria, se observó interacción entre los factores ploidía y estatus nutricional (F3,75 = 13.5, p < 0.0001). La mayor fuente de variación fue la condición de alimentación (37,2%), lo cual es esperable ya que CCK-8 es un modulador de la ingesta. En larvas diploides el ayuno disminuyó significativamente el número de células inmunorreactivas (Fig. 2A). La realimentación restableció los valores, incrementando significativamente luego de 3 horas en comparación con DA0 (Fig. 2A). Por el contrario, en los triploides, el ayuno no modificó el número de células inmunorreactivas (Fig. 2B), pero la realimentación determinó un incremento significativo luego de las 3 horas (Fig. 2B). Esto puede relacionarse con la función de CCK como estimulador de la secreción de enzimas digestivas, y por su rol como regulador de la saciedad post ingesta4. Cuando se compararon larvas diploides y triploides con un mismo estado nutricional, se observó que no existieron diferencias significativas entre DC y TC o DA0 y TA0. Sin embargo, los triploides mostraron un incremento significativo del número de células luego de 1 y 3 horas de ofrecido el alimento, revelando un comportamiento diferencial. En el análisis para NPY con un ANOVA a dos criterios, se observó una interacción no significativa entre ploidía y estatus alimentario. Por ello, la variable se comportó igual en diploides y triploides pese a la condición nutricional, aunque si se observó que hay efectos de los factores ploidía (F1,72 = 4.488, p = 0.0376) y estatus alimentario (F3,72 = 6.494, p = 0.0006). Al comparar para cada ploidía los efectos de la condición alimentaria en diploides el ayuno no modificó significativamente los valores de la variable (Fig.3A). Si bien de acuerdo a su función orexigénica era esperable un incremento en la expresión de NPY en ayunados, los resultados publicados revelan que el rol regulador de NPY podría ser especie específico. Así, los niveles de expresión en cerebro de juveniles de bacalao (Gadus morhua), en individuos ayunados durante 7 días no tuvieron diferencias significativas con los niveles medidos en individuos no ayunados2. Teniendo en cuenta que existen otros órganos que modulan la ingesta, no podemos descartar que el intestino cumpla un rol menor en la estimulación del apetito. Por otro lado, en triploides el ayuno no modificó la variable, pero hubo un aumento significativo de la misma luego de 1 y 3 horas de realimentación (Fig. 3B). Resultados similares fueron reportados en salmón del Atlántico (Salmo salar) y en larvas de fletán del Atlántico (Hippoglossus hippoglossus). En cuanto al efecto que tuvo la ploidía para cada condición alimentaria, se observó que solo los diploides ayunados presentaron diferencias estadísticamente significativas respecto a los triploides.Concluimos que el manejo de la ploidía y la condición alimentaria produce variaciones en la expresión de neuropéptidos moduladores de la ingesta NPY y CCK-8 en larvas de R. quelen. Nuestros resultados muestran por primera vez el efecto de la triploidía en la expresión de estos neuropéptidos en peces.