Evaluación de la expresión de hormona de crecimiento y miostatina en juveniles de Rhamdia quelen bajo condiciones de ayuno-realimentación.

MENDÍA, A.C.; MARCONATO, C.L.; BOAGLIO, A.C.; VIGLIANO, F.A.

Casilda

Jornada; XXI Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas; 2021

Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR

Para la región pampeana, el bagre sudamericano (R. quelen) es la especie nativa que mejor se adapta al cultivo semi-intensivo e intensivo gracias a su rusticidad y calidad de la carne. Estas características la convierten en una especie con potencial productivo. El tejido muscular constituye hasta un 70 % del peso corporal de las especies de peces comercialmente importantes, de ahí la relevancia en comprender los mecanismos fisiológicos que controlan el desarrollo muscular y su interacción con factores nutricionales y ambientales. El principal regulador del crecimiento muscular en relación a la disponibilidad de nutrientes es el sistema GH (Growth hormone) /IGF (Insulin Growth Factor). Particularmente, GH es una hormona producida por la hipófisis, que controla la hipertrofia e hiperplasia muscular actuando sobre la expresión génica de proteínas musculares estructurales, enzimas involucradas en proteólisis y en el metabolismo, factores reguladores de la miogénesis (MRFs) y de la atrofia muscular como miostatina. La miostatina es un regulador muscular negativo que inhibe la proliferación y diferenciación de mioblastos limitando la tasa de crecimiento y la masa muscular en los animales. Por otra parte, el modelo de ayuno-realimentación es un modelo experimental que permite identificar y evaluar los efectos de la alimentación sobre los mecanismos fisiológicos y endocrinos involucrados en el crecimiento. En base a lo expuesto anteriormente, el objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de GH y miostatina en juveniles diploides de Rhamdia quelen sometidos a un esquema de ayuno-realimentación. Los juveniles de 5 meses de edad fueron sometidos a un ayuno corto de 72 horas, seguido de periodos de realimentación de 1 y 3 horas. Los grupos experimentales se establecieron como grupo control (GC) (alimentados con la frecuencia habitual), grupo ayunado (GA), y grupos realimentados GR-1 y GR-3. Se tomaron muestras de hipófisis y músculo del pedúnculo caudal en 9 animales por grupo. Para evaluar los niveles de expresión génica relativa de GH, se extrajo ARN total a partir de homogenado de hipófisis de juveniles de R. quelen con reactivo Trizol (Invitrogen). A partir del ARN purificado total se sintetizó ADNc con Transcriptasa Reversa (Invitrogen). La RT-qPCR cuantitativa se realizó con los cebadores específicos para GH (gen de interés) y β actina (gen normalizador) de R. quelen, disponibles en el GenBank (N° EF101341 y N° KC195970, respectivamente). El tamaño de amplicón para GH fue de 116 pares de bases (pb) y para β-actina de 112 pb. Las mediciones de RT-qPCR se realizaron por triplicado y se utilizó Master mix Syber Green (Invitrogen). Para evaluar la expresión génica relativa de GH se utilizó el método 2- ΔΔCt. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA a un criterio seguido del test de comparaciones múltiples Dunnett. Para determinar la concentración y pureza del ARN se midió absorbancia a 260 y 280 nm. Por otra parte, para determinar la expresión proteica relativa de miostatina se obtuvo un homogenado de musculo blanco, se determinó la concentración de proteínas totales por el método de Lowry y se procedió a realizar un Western blot. Las membranas de PVDF conteniendo las proteínas fueron incubadas con anticuerpo primario anti-miostatina (ab98337, 1:200, 4°C, over night) o anti-GADPH (ab9485, 1:1000; 4°C, over night), que se utilizó como control de carga. Luego se incubó con anticuerpo secundario anti-conejo o anti-ratón (1:7000, 25°C, 1 h). Finalmente, se las embebió con el reactivo ECL (Thermo Fisher) y se utilizaron membranas sensibles a quimioluminiscencia para el revelado. Se realizó un análisis densimétrico de las intensidades de las bandas con el programa Image J y el análisis estadístico se llevó adelante con un ANOVA a un criterio seguido del postest Tukey.Previo a la determinación de la expresión relativa de GH en condiciones de ayuno-realimentación, se verificó que los genes de GH y β-actina presentaran una eficiencia similar. Para ello se obtuvieron las correspondientes curvas estándar [Ct vs Cantidad (Copias)] con diluciones seriadas 1/3 de ADNc. Los valores de eficiencia para GH y β-actina fueron 98,76% y 99,61%, respectivamente.Los resultados de los niveles de expresión relativa de GH se resumen en la Tabla 1. Se puede apreciar que en el grupo ayunado (GA) se incrementa la expresión de GH en relación con el control (GC, alimentado). Este fenómeno se ha visto en otras especies de peces con aumento de GH tanto a nivel de ARNm como proteína en plasma y estaría relacionado con una aparente resistencia a GH y alteraciones en el funcionamiento de la cascada de señalización del eje GH/IGF. En este sentido, el aumento de GH se correlacionó con una disminución de IGF-1 en Oncorhynchus tshawytscha durante periodos de ayuno similares al empleado en nuestro esquema. Esto podría relacionarse a la inhibición del IGF-1 por la GH en algún punto por debajo del GHR (Growth Hormone Receptor) en la cascada de señalización, como ocurriría en Oreochromis mossambicus y Oncorhynchus mykiss. Durante la realimentación los niveles de expresión de GH disminuyen en relación a GA, tendiendo a valores semejantes al GC.Para confirmar fehacientemente si este fenómeno se replica en R. quelen, a futuro se deberán evaluar también los niveles de expresión de IGFs y IGFR, así como los valores de peso de los peces sometidos al esquema de ayuno-realimentación. En relación a la expresión relativa de miostatina, no se observaron diferencias significativas entre los grupos ayunados (0,93±0,27) y realimentados durante 1 y 3 h (1,37±0,26 y 1,58±0,50; respectivamente) en comparación al grupo control (1,00±0). Este resultado es coincidente con un estudio realizado por nuestro grupo en larvas de R. quelen sometidas a ayuno-realimentación y con juveniles de Oreochromis niloticus bajo condiciones de ayuno corto. Esto podría ser indicativo de que miostatina no es susceptible a cambios en las condiciones nutricionales, durante los periodos cortos de tiempo evaluados. Por último, es pertinente mencionar que la regulación de la miogénesis es un proceso complejo, en el cual los niveles de expresión de las proteínas miogénicas y del eje GH/IGF varían sustancialmente en relación a las condiciones específicas de cultivo, el estadio de vida del pez y la especie, entre otros factores.