Identificación de especies del complejo Cryptococcus mediante métodos moleculares. Estudio preliminar

BLANCO N; SOSA MA; GIUSIANO G; MANGIATERRA M; ROJAS F

Jornada; Reunión de Comunicaciones Cintíficas y Teconlógicas 2010. Universidad Nacional del Nordeste; 2010

Universidad Nacional del Nordeste

Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii son hongos levaduriformes, pertenecientes al complejo Cryptoccocus, incluidos dentro de los basidiomicetes. Estas levaduras patógenas son agentes causales de enfermedades pulmonares, meningitis y meningoencefalitis. Cryptococcus neoformans (Cr. neoformans) es cosmopolita y afecta principalmente a pacientes inmunodeprimidos, mientras que Cr. gattii prevalece en zonas tropicales y subtropicales y puede afectar a individuos inmunocompetentes. Las infecciones causadas por Cr. gattii requieren tratamientos prolongados y están asociadas a una alta frecuencia de formación de cripotocomas con secuelas neurológicas severas. La diferenciación entre las dos especies se realiza tradicionalmente con el medio CGB (Canavanina - Glicina - Azul de Bromotimol), pero se han detectado un alto porcentaje, tanto de falsos positivos como negativos, generando un error en el diagnostico de laboratorio. No existe otro método convencional de discriminación disponible. El objetivo de este trabajo fue encontrar una metodología molecular que permita la identificación de las especies de Cryptococcus, actualmente conocidas como potencialmente patógenas, de manera específica, práctica y económica. Se estudiaron aislamientos clínicos y ambientales provenientes del Laboratorio Central de Corrientes y del Instituto de Medicina Regional (UNNE) de Resistencia. Las cepas se repicaron en Agar Sabouraud y se incubaron a 32ºC, durante 3 días. Para la extracción y purificación del DNA de las levaduras la lisis celular se realizó por shock térmico, en agua bidestilada libre de DNAsas y luego el extracto crudo se purificó con cloroformo-alcohol isoamilico (24:1). La PCR Multiplex se realizó en base a las experiencias de Leal y col. La reacción de amplificación fue realizada en un volumen final de 25l, conteniendo Buffer 1x, 200 M de cada dNTP, 2,3 mmoles de MgCl2, 1U de Taq DNA polimerasa, 25 pmol de cada cebador y 5 l de DNA. Programa de amplificación: desnaturalización inicial a 94ºC (8 min), 35 ciclos de 94ºC (1min), 65ºC (1min) y 72ºC (2 min) y extensión final a 72ºC (8 min). Los fragmentos obtenidos fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa y revelados con bromuro de etidio. Cr. neoformans presentó una banda especifica a 685 pb y Cr. gattii a 448 pb aproximadamente. La extracción de ADN aplicando shock térmico, nos dio muy buen resultado, a diferencia de la metodología de Leal y col. y otros autores que proponen métodos más laboriosos. Por otro lado, este procedimiento evita la aplicación de kits comerciales, o el uso de fenol: cloroformo:alcohol isoamílico para la extracción, lo que reduce el tiempo de extracción, evita el uso de reactivos tóxicos y disminuye los costos de la técnica. La aplicación de esta PCR Multiplex para la tipificación de especies de Crytococcus, requiere poco tiempo de trabajo a partir del desarrollo de las levaduras en el cultivo. Es potencialmente aplicable para la identificación en muestra clínica, ya que no amplifica DNA de otros microorganismos ni DNA humano.