Estudio de Integrinas y su Regulación por el Sistema Inmune Innato y Adquirido durante la placentación porcina.

VELEZ, CAROLINA; BARBEITO, CLAUDIO GUSTAVO; KONCURAT, MIRTA

Mar del Plata

Congreso; XVIII Jornadas de Actualización Porcina, XII Congreso Nacional de Producción Porcina, VII Congreso de Producción Porcina del Mercosur.; 2014

Facultad de Ciencias Veterinarias UNRC.

HipótesisLa gestación es un fenómeno fisiológico que obedece a precisas interacciones entre el conceptus y su madre, resultando en un diálogo entre ambos individuos genéticamente diferentes que involucran al sistema inmunológico y que minimiza las posibilidades de rechazo del embrión. Además de las moléculas de adhesión que permitirán el anclaje de los epitelios materno y fetal, numerosas hormonas y factores de crecimiento actúan de manera sistematizada permitiendo el éxito de la gestación. La placenta porcina es de tipo epiteliocorial, no invasiva, adecidua, plegada y difusa y desempeña sus funciones si se produce la correcta adhesión y fijación de las células trofoblásticas fetales con las células epiteliales endometriales. Se postula que en la gestación porcina habría una relación entre el sistema inmune materno y la expresión de las integrinas y sus ligandos en la interfase feto-placentaria.Objetivo GeneralEstudiar el rol de las integrinas y sus ligandos en placentas porcinas provenientes de diferentes períodos gestacionales, tratando de individualizar moléculas implicadas en los procesos de adhesión placentaria durante la gestación porcina y su posible interrelación con el sistema inmunológico. Se cumplirá con dicho objetivo observando en primer término la expresión de determinadas integrinas y sus ligandos sobre preparados histológicos de placentas porcinas de diferentes períodos de preñez y determinando la interleuquinas en suero y homogenatos de placenta porcinas (HoPP) provenientes de diferentes períodos gestacionales. Con esos resultados se tratará de establecer posibles relaciones entre los niveles de citoquinas con la expresión de integrinas y sus ligandos hallados durante el desarrollo placentario de la preñez porcina.Materiales y Métodos Animales. Se procesarán 20 tractos reproductivos de cerdas mestizas provenientes de frigoríficos de la zona de General Pico, La Pampa. Se extraerán, como mínimo, 5 muestras placentarias de 30 días de gestación (dg), 5 de 60-70 dg y 5 muestras de placenta a término (114 dg) y un mínimo de 5 muestras de útero vacío de cerdas no gestantes. Además, se extraerá sangre de cada animal para la obtención de suero.Se estimará la edad gestacional de las placentas de acuerdo a la longitud céfalo-caudal de los fetos obtenidos de cada cerda gestante (Marrable, 1971) y se determinará el sexo y peso de cada feto extraído. Obtención de Suero. Se extrajo sangre por el método de flevopunción. En el caso de muestras de frigorífico, se obtuvo la sangre por corte de la vena yugular. La sangre se incubó a temperatura ambiente para la retracción del coágulo y exudado del suero. Luego se centrifugó a 1800 rpm durante 10 minutos (mín.), se alicuotó y conservó a ?20ºC hasta su uso.Obtención de Homogenatos de Placenta Materna Porcina (HoPM), Homogenatos de Placenta Fetal Porcina (HoPF) y de Útero Porcino (HoU). Se desmenuzó ± 5 g de tejido placentario porcino con tijeras y mortero. Una parte de la pulpa de tejido se homogenizó con tres partes de solución fisiológica. Luego se centrifugó a 500g durante 5 minutos, dos veces. El sobrenadante se alicuotó en tubos eppendorf y se conservaron a ? 20°C hasta su uso.Análisis de la estructura de la placenta y útero. Se realizaron cortes de interfase placentaria y útero no gestante según procedimiento histológico de rutina. Se tiñeron con Hematoxilina-Eosina y se observaron con un microscopio óptico (Carl Zeiss, Alemania).Cuantificación de Integrinas y Ligandos en muestras de tejido placentario fetal, materno y útero no gestante porcino. Se estudiará la expresión de integrinas αVβ3, α5β1 y a2b1 y sus ligandos: colágeno V, laminina y fibronectina (FN). Mediante la técnica de inmunohistoquímica indirecta, LSAB (Labeled Strptavidin Biotin Method), sobre cortes de tejido placentario desparafinados provenientes de los períodos seleccionados, se utilizarán anticuerpos específicos de actividad ya probada en tejidos de cerdo por inmunoperoxidasa. Para la determinación de la expresión de la integrina αVβ3 se utilizó un anticuerpo monoclonal conjugado con biotina (Chemicon, USA), y para la determinación de la FN se utilizaron dos anticuerpos: Fibronectin (C-20), policlonal (Santa Cruz Biotechnology, USA) y Anti-fibronectin, policlonal (Abcam Inc., Cambridge, UK). Determinación del porcentaje de área de inmunomarcaje (%AIM) a FN: se tomaron microfotografías (n=15) de cada estructura estudiada: epitelio luminal endometrial, epitelio glandular y trofoblasto, como mínimo, sobre 2 portaobjetos por cada período de gestación elegido. Sobre ellas se aplicó el software Image Pro-plus® 3.0 (Media Cybernetics, USA).Determinación de interleuquinas en HoU, HoPM, HoPF y Sueros Porcinos. Se realizará mediante kits comerciales específicos la determinación de las interleuquinas: IL-2, IL-4 e IL-10 en los extractos placentarios maternos, fetales y sueros porcinos provenientes de los períodos de gestación seleccionados, así como en los extractos de útero vacío. La técnica que se aplicará será ELISA de captura.Análisis de los resultados: Los resultados de inmunohistoquímica indirecta, LSAB, fueron expresados en forma semicualitativa, con una escala elegida en función de la coloración detectada, determinando que: (-)= negativo, (+)= positividad leve, (++)= positividad moderada y (+++)= positividad fuerte. Con respecto a los resultados de las interleuquinas y del %AIM, dado que hay más de dos poblaciones en estudio se harán las correspondientes comparaciones a través de un ANOVA. En caso de que no se verifiquen los supuestos de homogeneidad de varianza y normalidad se utilizarán test no paramétricos. ResultadosSe halló mayor expresión (++ y +++) de FN y de αVβ3 en la porción apical de las células trofoblásticas de 17, 35 y 60 dg; marcación que disminuyó a partir de los 70 dg, positivándose a término (114dg). Se obtuvo similar patrón de inmunomarcaje con respecto a la expresión de estas moléculas en el epitelio endometrial, observando una tinción más leve, y manteniéndose negativa su expresión en esta estructura a los 114dg. Con respecto a las glándulas endometriales, no se encontró positividad de FN ni de la integrina αVβ3 en el epitelio glandular endometrial durante la gestación, sólo se encontró positividad citoplasmática al final de la preñez. El útero no gestante no expresó inmunotinción de ninguna de las dos moléculas estudiadas.Con respecto al porcentaje de área inmunomarcada de la fibronectina, en el epitelio endometrial se hallaron diferencias significativas entre los períodos de gestación, aumentando el área de expresión de FN a medida que avanzó la gestación (13% a 48% y 25% a 34% aprox. en células endometriales y trofoblásticas, respectivamente). Las células epiteliales glandulares sólo mostraron inmunomarcación a los 107 dg, cubriendo el 52,23% del citoplasma. En las células trofoblásticas no se encontró diferencias significativas entre los períodos de 17 y 32 dg, pero sí se observó diferencias significativas en el %AIM a los 60 dg con respecto al principio de la preñez. DiscusiónEn cerdos, dado el tipo de placenta epiteliocorial y no invasiva, la relación entre los epitelios trofoblástico y endometrial permite la constitución de la placenta a través de la interacción entre moléculas de adhesión y sus ligandos. Para que la gestación progrese, es necesario que se establezca una interacción entre el conceptus y el endometrio, que involucra, entre otras, a las moléculas de adhesión y sus ligandos, que serían las responsables del reconocimiento y anclaje de los epitelios materno y fetal en la interfase placentaria porcina. Coincidiendo con otros autores, los epitelios que forman parte de la interfase feto-materna durante la preñez porcina expresaron fibronectina e integrina αVβ3 tanto sobre las células trofoblásticas como sobre los tejidos endometriales uterinos, aumentando la intensidad de la marcación a medida que la formación de la placenta avanza, haciéndose negativa a término. La inmunomarcación citoplasmática de estas moléculas fue más intensa en el trofoblasto que en el epitelio luminal endometrial. No hay trabajos que determinen los porcentajes de AIM de FN en la placenta porcina. Nosotros comparamos los porcentajes del AIM entre ambos epitelios de la interfase feto-materna y observamos que hay diferencia significativa entre el área inmunomarcada endometrial y trofoblástica, siendo mayor el área marcada de las células endometriales a los 32 y 60 dg; aumentando este porcentaje a medida que avanza la gestación. En cuanto al trofoblasto, no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de área marcada hasta los 60 dg. Según estudios de apoptosis realizados en nuestro laboratorio, hacia los 60 dg se observa la mayor remodelación de las vellosidades placentarias, dado que cesa el crecimiento exponencial de la placenta para dar lugar al crecimiento de los fetos. Es importante señalar que se encontró una mayor positividad y porcentaje de área inmunomarcada a FN también durante este período. Hemos demostrado en nuestro laboratorio la correlación de los niveles de progesterona y estrógenos, tanto a nivel sistémico como localmente en la interfase feto-placentaria, con la expresión de las moléculas de adhesión y sus ligandos. En conclusión, con base en los resultados obtenidos hasta la fecha, se sugiere que la fibronectina y la integrina αVβ3 estarían involucradas en los mecanismos moleculares que participan en la adhesión y fijación de los epitelios que conforman la interfase feto-materna durante la placentación porcina.