Producción de matrices poliméricas para adsorción de celulasa de Aspergillus niger

MENGARELLI DIEGO; BOGGIONE MARÍA JULIA; FARRUGGIA BEATRIZ

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

SAPROBIO

PRODUCCIÓN DE MATRICES POLIMÉRICAS PARA ADSORCIÓN DE CELULASA DE Aspergillus nigerMengarelli,Diego; Boggione, M. Julia, Farruggia, BeatrizIPROByQ. ?Laboratorio de Fisicoquímica aplicada a la bioseparación? Área Fisicoquímica. Departamento de Química Física de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Suipacha 531, 2000 Rosario. UNR.bfarrug@fbioyf.unr.edu.arIntroducciónLas técnicas de purificación de proteínas (downstream-processing) establecidas en laboratorios bioquímicos o de biología molecular no se ajustan a los requerimientos de costo-calidad industriales, por lo cual debe primero realizarse el escalado de los protocolos de laboratorio tratando de no incrementar el número de operaciones unitarias utilizadas, ni disminuir los rendimientos. Los pasos de un procedimiento estándar de purificación de enzimas incluyen: clarificación, concentración, purificación gruesa y purificación fina. La metodología seleccionada debe permitir llevar a cabo la separación sin comprometer las propiedades del producto final debe contemplar el menor número de pasos, que sean fácilmente escalables, no contaminantes y económicos. La adsorción en matrices poliméricas porosaspuede retener partículas desde un fluido en su superficie.La estrategia separativa consta de la realización secuencial de distintas etapas como la adsorción, el lavado, en la cual se elimina el material no adsorbido a la matrizy la desorción o elución, en la cual se pone en contacto el adsorbente con una solución buffer de pH y fuerza iónica adecuada que permita la recuperación de la proteína purificada respecto de la situación inicial. Finalmente la última etapa es la de ?regeneración de la matriz? mediante lavado de la misma de los residuos del eluyente para retornar a la misma a la situación inicial.La celulasa es un complejo enzimático capaz de degradar celulosa. Está conformado por endo-1,4-β-D-glucanasa, exo-1,4-β-D-glucanasa y β-D-glucosidasa. Son enzimas de importancia biotecnológica por sus aplicaciones en las industrias alimenticia, textil, del papel, para la fermentación de biomasa en biocombustibles y en aplicaciones farmacéuticas así como en investigaciones biológicas.El Aspergillus nigeres un hongo productor de celulasa muy utilizado industrialmente.El objetivo del presente trabajo fue producir matrices de polímeros como eudragit, chitosán y agarosa que puedan ser utilizadas para la adsorción de celulasa fúngica.MetodologíaLas matrices de chitosán-eudragitEpo(CHIEPO) fueron preparadas a partir de una solución mixta de los polímeros en ácido acético por goteo de la mezcla desde una jeringa con aguja fina en una solución de NaOH 2M. Se dejaron madurar en NaOH 1M una semana y se guardaron en NaOH 0,1 M. La producción de las matrices de EudragitEpo-Goma Guar-Alginato(AGGEPO) se consiguió en dos etapas, se mezclaron los dos primeros polímeros manteniendo la agitación durante 24 hsen agua a pH~4,5. En una segunda etapa se incorporó el alginato continuando la agitación hasta disolución completa y por goteo sobre una solución de CaCl2 1M se obtuvieron las matrices. La maduración, de una semana, se llevó a cabo en una solución de CaCl2 0,1 M NaOH 1M y la conservación fue en agua o en CaCl2 0,1M.Mediante curvas de titulación ácido-base se caracterizaron las mencionadas matrices. Se estudió la cinética de adsorción y desorción de la enzima sobre las matrices poniendo en contacto la enzima con una cantidad fija de matriz y determinando la concentración de proteínas totales y enzimas para los diferentes tiempos de contacto. La adsorción se llevó a cabo con agitación orbital de 120 rpm. Luego, se procedió a lavar la matriz separándola con un colador de poro fino y poniéndola en contacto con el buffer correspondiente, con agitación. La desorción de la enzima desde las matrices lavadas fue producida con buffer de fuerza iónica determinada en experiencias anteriores. Se determinó actividad enzimática y concentración de proteínas totales en el sobrenadante de la desorción a los distintos tiempos. Durante el transcurso de la desorción se mantuvo el sistema en agitación orbital a 80 rpm.Resultados y ConclusionesEn la Figura 1 se muestran las curvas de titulación de las dos matrices estudiadas como forma de caracterizarlas y compararlas con otras matrices simples producidas anteriormente (esferas de quitosan, CHI y de Alginato-Goma Guar, AGG). Puede observarse que las AGGEPO y CHIEPO poseen mayor carga a pHs extremos respecto de las matrices simples. Debido a que el punto isoeléctrico de la celulasa es de alrededor de 4.8 se encontrará cargada positivamente a pH 3 y negativamente a pH 7, los cuales fueron los seleccinados para llevar a cabo las adsorciones. La cinética de la adsorción de la enzimase presenta en la Figura 2, en un gráfico de actividad específica en función del tiempopara las diferentes matrices, mostrando que la CHIEPO a pH 7a los 60 min adsorbe la máxima cantidad de endocelulasa.Las pérdidas de proteínas en el lavado respecto a la cantidad adsorbida es del56%, 40% y del 52% para los sistemas estudiados en este orden AGGEPO pH 3, AGGEPO pH 7 y CHIEPO pH 6. Los porcentajes de proteínas desorbida post-lavado fue del 76%, 66% y 82% respectivamente.La adsorción de la endocelulasa con la matriz de chitosán-eudragit es probable que sea de naturaleza electrostática debido a que se produce la máxima adsorción con la matriz que mayor carga posee en las condiciones analizadas. A su vez la recuperación, medido como proteínas totales, es también mayor para este sistema. Serán analizadas posteriormente diferentes condiciones de elución y se estudiara más detalladamente la adsorción para optimizar los resultados de la purificación de la endocelulasa.