Expresión de las proteínas E(rns) y E2 del virus de la diarrea viral bovina (VDVB) en células procariotas: determinación de su capacidad antigénica

S CHIMENO ZOTH; O TABOGA; M FERRER; E PALMA; M PICCONE

Buenos Aires

Congreso; VII Congreso Argentino de Virología; 2002

El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es un miembro del género Pestivirus, familia Flaviviridae. Constituye uno de los principales patógenos virales que afecta al ganado, ocasionando importantes pérdidas económicas ligadas, principalmente, a las fallas reproductivas asociadas (abortos, malformaciones congénitas, etc.). El VDVB posee un genoma de ARN de cadena simple y polaridad positiva, cuya longitud es de aproximadamente 12.5 Kb. El mismo codifica para  al menos 10 proteínas estructurales y no estructurales. Dentro de las estructurales, las glicoproteínas E(rns) y E2 han demostrado ser las más inmunogénicas, siendo esta última la principal inductora de anticuerpos neutralizantes. Debido a esta propiedad, E(rns) y E2 constituyen los candidatos por excelencia para el desarrollo de métodos de diagnóstico de la infección por VDVB y de vacunas a subunidad. En trabajos previos hemos descripto la expresión y caracterización de E(rns), E2 y del precursor E(rns)-E1-E2 en el sistema eucariota baculovirus / células de insecto (Sf9). De esta manera obtuvimos los antígenos recombinantes para el desarrollo de un ensayo de ELISA, necesario para la detección de anticuerpos anti-VDVB en sueros bovinos y de una vacuna a subunidad que pudiera resultar más segura y eficaz que las actualmente utilizadas. Ante los ensayos de inmunización realizados en ratones y conejos (como paso previo al ensayo en bovinos), surgió la necesidad de disponer de los mismos antígenos expresados en un sistema diferente, con el fin de utilizarlos como reactivo para analizar los sueros de los animales inmunizados. De esta manera, el objetivo de este trabajo ha sido expresar las proteínas E(rns) y E2 de la cepa NADL de VDVB en células procariotas y evaluar su eficacia en el reconocimiento de anticuerpos específicos presentes en los sueros de los animales inmunizados con los antígenos correspondientes expresados en células Sf9. Las regiones codificantes para E(rns) y E2 se amplificaron por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando como templado las mismas regiones anteriormente clonadas y secuenciadas en su totalidad. En esta oportunidad, los productos de PCR excluyeron los extremos amino y carboxilo - terminales, con el fin de evitar la presencia de tramos hidrofóbicos que dificultaran la expresión en bacterias. Los productos de PCR se clonaron  en el vector pRSET-A. Con las construcciones obtenidas (pRSET/E(rns), pRSET/E2 y pRSET) se transformaron bacterias E. coli DH5alfa y, posteriormente (una vez confirmada la identidad de los fragmentos clonados), se transformaron células E. coli BL21 pLys E (Invitrogen). La expresión proteica se indujo mediante el agregado de Isopropil-b-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a los cultivos. Los extractos bacterianos se analizaron por SDS-PAGE y Western-blot revelado con un anticuerpo monoclonal anti-polihistidina. En ambos casos, la banda obtenida coincidió con el peso molecular esperado, confirmando así la expresión de las proteínas de interés. Posteriormente se realizaron ensayos de Western-blot en los que se enfrentó a los antígenos bacterianos con anticuerpos monoclonales específicos y con sueros de ratón y de conejo, producidos en nuestro laboratorio por inmunización de los animales con extractos de células Sf9 infectadas con baculovirus recombinantes para E(rns) y E2. Todos los sueros evaluados reconocieron a E(rns) bacteriana. De esta manera se pudo verificar la presencia de anticuerpos específicos en sueros de animales que, habiendo sido inmunizados con E(rns), resultaron negativos en ensayos de seroneutralización viral. No sucedió lo mismo con E2 obtenida en bacterias, ya que en este caso, ninguno de los sueros evaluados pudo reconocer el antígeno de origen bacteriano. Ensayos en curso permitirán dilucidar si es la falta de la secuencias amino y carboxilo - terminal, la glicosilación o ambas, responsables de la falta de reconocimiento inmunológico de E2 expresada en bacterias.