Diseño y construcción de vectores de transferencia para la obtención de Virus Vaccinia Ankara Modificado recombinantes

M.F. FERRER Y G. CALAMANTE

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XIX Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias; 2004

Los poxvirus se utilizan eficientemente como vectores para la expresión de genes foráneos y para la construcción de vacunas contra enfermedades infecciosas. En los últimos años los investigadores se focalizaron en la obtención de cepas del virus vaccinia altamente atenuadas y con una mayor restricción del rango de hospedadores. Así, se aisló la cepa MVA (virus vaccinia Ankara modificado) que no replica en la mayoría de las células de mamíferos. El análisis de la secuencia completa del genoma de MVA demostró que posee grandes deleciones que incluyen genes relacionados con virulencia y rango de hospedadores. El objetivo de nuestro trabajo es el desarrollo de vacunas basadas en MVA recombinantes para la prevención de enfermedades de interés pecuario. La inmunización se consigue en ausencia de replicación viral, eliminándose la posibilidad de diseminación del vector en animales vacunados y hacia otros animales o hacia el medioambiente. Para la obtención de los MVA recombinantes es fundamental diseñar y construir los vectores de transferencia, que llevan secuencias homólogas a regiones del genoma viral que serán el blanco de inserción del gen de interés y permitirán la recombinación homóloga con el virus salvaje. Estas secuencias se encuentran interrumpidas por un “cassette de expresión” que posee el gen de interés bajo regulación de un promotor adecuado. En este trabajo se presenta el diseño y la construcción de los vectores de transferencia para obtener MVA recombinantes.En base a los resultados obtenidos con las cepas patogénicas del virus vaccinia y al análisis de la secuencia genómica de MVA decidimos utilizar como sitios blanco de inserción a los genes que codifican para timidina kinasa (TK) y hemoaglutinina (HA). Se diseñaron oligonucleótidos específicos para amplificar y clonar las secuencias genómicas de TK y HA. A partir del ADN genómico viral purificado de células BHK-21 infectadas con MVA se amplificaron por PCR dichas regiones genómicas. En cada caso se amplificaron 2 regiones denominadas izquierda y derecha que corresponden a las posiciones 1-303 y 608-948 del gen de HA y 1-244 y 325-534 del gen de TK. Posteriomente estos fragmentos se clonaron direccionalmente en pBlueScript y la identidad de los mismos se confirmó por secuenciación. Así, se obtuvieron los vectores de transferencia VT-MVA/HA y VT-MVA/TK. En el futuro, los cassettes para la expresión de proteínas inmunogénicas de diferentes patógenos animales se clonarán en estos vectores para obtener los MVA recombinantes candidatos a ser utilizados como vacunas de nueva generación.