CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

Con el objetivo de caracterizar la variante patógena de JUNV P3441 (P) a nivel molecular, se infectaron células BHK con la cepa P en MOI 1. A los 3 días post-infección, se recolectaron las células y se utilizó el reactivo TransZol (TransGen Biotech) para extraer el ARN total. Posteriormente, se incubaron 2 µg de ARN viral con 1 µl de transcriptasa inversa (Superscript IV, Invitrogen) y cebadores aleatorios (50 µM, Invitrogen) durante 10 min a 25ºC seguido de incubación a 50ºC durante 50 min. Luego, se usó 1 µl de ADNc como molde en cada PCR posterior usando 17 pares de cebadores para amplificar el genoma completo. Los fragmentos amplificados se enviaron a Macrogen (Corea) para secuenciación de electroforesis capilar seguida de análisis utilizando el software Ugene.Los resultados mostraron 59 diferencias en el genoma entre P y la cepa atenuada vacunal Candid 1 (C#1), incluidas algunas con funciones biológicas potenciales como la proteína N R476, dentro de un dominio de unión a Z, D511 y L546, conservados en varias cepas patógenas y la proteína Z V64 dentro del dominio Z RING. La proteína L mostró más de 40 diferencias con C#1, pero su relevancia es incierta ya que ninguna está dentro de los dominios funcionales conocidos hasta ahora. GPC mostró poseer todas las mutaciones puntuales que han sido estudiadas por otros grupos. Luego, se diseñaron cebadores específicos para amplificar los 4 ORF de JUNV. Se obtuvieron fragmentos del tamaño esperado para los ORF que codifican Z, N y GPC. En el caso de L, se obtuvieron cuatro fragmentos. Luego, los fragmentos se clonaron en el vector pGEM-T (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Hasta el momento, se han clonado todos los ORF excepto un fragmento L, que todavía está en curso.Concluimos que nuestro enfoque fue útil para conocer la secuencia del genoma de esta variante viral, así como para generar herramientas moleculares para futuros estudios.

enviar mensaje