Tratamiento de efluentes aplicando el concepto de biorefineria: bioetanol a partir de descartes industriales

CARRERAS, AA; ISLA, MA; COMELLI, RN

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAProBio); 2014

INTRODUCCIÓN Algunos efluentes líquidos de las industrias de bebidas gaseosas, en particular aquellos generados por ?operaciones de descarte? (producto rechazado durante el proceso de elaboración por políticas de calidad, producto devuelto desde góndola por falta de gas o cumplimiento de la fecha de vencimiento, entre otros), presentan un tenor de azúcares simples (glucosa, fructosa y/o sacarosa) que oscila entre 100 y 120 g/L. Además tienen la particularidad de exhibir una alta carga orgánica, con una Demanda Química de Oxígeno (DQO) que puede alcanzar valores de hasta 150.000 mg O2/L, lo que hace necesario su tratamiento previo al volcado a un cuerpo receptor. Estudios previos (Isla y col., 2013; Comelli y col., 2013) han demostrado que la fermentación alcohólica, mediada por levaduras, para la producción de bioetanol en forma ?batch? a partir de efluentes de la industria de bebidas gaseosas es un proceso técnicamente factible. Aparte del beneficio económico que representaría la comercialización del bioetanol (biocombustible de alta demanda en la actualidad) y el aprovechamiento del CO2, este proceso se traduciría en una disminución en los costos de tratamiento del efluente en cuestión.   En los efluentes en estudio, la fuente de carbono, utilizable por las levaduras, es provista por los endulzantes empleados en las gaseosas (sacarosa y/o jarabe de maíz de alta fructosa, una mezcla de fructosa y glucosa), mientras que son deficitarios en el contenido de nitrógeno. Diferentes fuentes de nitrógeno pueden afectar las velocidades de formación de diferentes productos y activar o silenciar variadas rutas metabólicas (Albers y col. ,1996), por lo que el estudio de este aspecto resulta de importancia para garantizar el éxito de la fermentación alcohólica de efluentes industriales y obtener el máximo rendimiento en etanol. En el presente trabajo, se decidió evaluar y comparar el impacto de diferentes fuentes de nitrógeno sobre el desempeño de las levaduras, optimizar la productividad de las levaduras aplicando metodologías de superficie de respuestas y desarrollar un medio mineral sencillo y económico que permita reemplazar el extracto de levaduras como suplemento nutricional.   METODOLOGÍA Las fermentaciones se llevaron a cabo en reactores tanque agitados (de 50 mL y 500 mL) construidos ad-hoc, con sistemas de trampa de gases y toma-muestra para mantener esterilidad y anaerobiosis. Los reactores fueron operados en forma ?batch? bajo condiciones anaeróbicas y temperatura constante de 30º C. Todos los ensayos se realizaron por duplicado, contabilizándose el tiempo de inicio de la fermentación a partir de la inoculación. Las muestras se recogieron por duplicado inmediatamente después de la inoculación  y cada 1.5  h hasta el final del experimento. La concentración inicial de levaduras en cada ensayo fue de 2.00 +/- 0.20 g/L. Las células se cultivaron previamente a 30º C durante 12-18 h en medio YPD (2 g/L peptona de carne; 5 g/L extracto de levaduras y 20 g/L glucosa).En todos los experimentos se empleó la levadura comercial Saccharomyces cerevisiae var. Windsor (tipo ALE). En los ensayos de fermentación se emplearon dos medios diferentes: uno compuesto de una mezcla de bebidas gaseosas (formulada en función de los volúmenes de comercialización de las bebidas: tipo cola 65 %, naranja 7 % y lima-limón 28% y asumiendo un descarte proporcional)  y otro sintético conteniendo sacarosa y/o una mezcla de glucosa-fructosa en la misma proporción que la encontrada en las bebidas gaseosas. Los medios fueron suplementados con extracto de levadura comercial 15 g/L  o mezclas de sales inorgánicas: Urea (CH4N2O), Sulfato de amonio [(NH4)2SO4], sulfato de cinc (ZnSO4.7H2O), Sulfato de Magnesio (MgSO4.7H2O) y Fosfato de Potasio (K2HPO4). Se realizó un seguimiento en el tiempo de los siguientes parámetros: 1) Etanol, mediante el empleo de un equipo estático desarrollado por el grupo de trabajo sobre la base de un sensor de alcohol de óxido de estaño (marca Fígaro TGS 2620). 2) Azúcares, por métodos espectrofotométricos. Los azúcares reductores se determinaron por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS; Miller, 1959) y los azúcares totales mediante el método ?fenol-sulfúrico? (Dubois y col., 1956). 3) Biomasa, asimilando su concentración a Sólidos Suspendidos Totales (SST), determinados por espectrofotometría a 600 nm utilizando una técnica estándar (Eaton, 2005); 4) Glicerol, mediante un kit enzimático.   RESULTADOS Se aplicaron diseños experimentales que permitieron identificar minerales que afectaron en forma positiva y estadísticamente significativa el desempeño de las levaduras, entre ellos, el magnesio y el cinc (no se muestra). Por otro lado, se ensayaron y compararon diferentes fuentes de nitrógeno: sulfato de amonio y urea como fuentes de N inorgánico y extracto de levadura comercial como fuente de N orgánico (aporta aminoácidos y pequeños péptidos). Los ensayos de fermentación fueron realizados por duplicado, empleando medios sintéticos (similares en composición al efluente de interés) y se registró la evolución en el tiempo de las concentraciones de biomasa, azucares y etanol. Con estos datos se calculó el Rendimiento en etanol (Ye, g etanol/g azúcar consumido) y este parámetro se utilizó como variable de respuesta para el análisis estadístico de los resultados. Aplicando la Metodología de Superficies de Respuesta se identificó una relación óptima de sales inorgánicas sencillas que permite obtener los rendimientos máximos en etanol. Las combinaciones óptimas de sales, según la fuente de nitrógeno empleada, fueron: *Suplemento 1: Urea 4.6 g/L; Fosfato de potasio 13 g/L *Suplemento 2: Sulfato de amonio 10.5 g/L; Fosfato de potasio 16.4 g/L. En ambos casos, la concentración de Sulfato de Magnesio y Cinc fueron, respectivamente: 6.25 g/L y 7.5 mg/L Estudios previos demostraron que el desempeño de las levaduras sobre una mezcla de gaseosas es superior respecto al observado sobre los sabores en forma individual, indicando que no sería necesario segregar por sabores en una potencial planta de producción de bioethanol. Para evaluar la factibilidad técnica de emplear los suplementos minerales reportados en este trabajo, se llevó a cabo fermentaciones sobre la mezcla de gaseosas y se registró la evolución de la concentración de biomasa, etanol y azúcar a lo largo del tiempo. Con fines comparativos, se incluyen los datos de fermentaciones empleando extracto de levadura comercial como suplemento. Los rendimientos en etanol (Ye ), glicerol (Yg )(subproducto de la fermentación alcohólica) y biomasa (Yb ), de los ensayos sobre mezcla de bebidas gaseosas, se presentan en la tabla 1.   Tabla 1. Rendimientos en etanol,  glicerol  y biomasa, de las fermentaciones realizadas.   Suplemento 1  (Urea) Suplemento 2 (Sulfato de amonio) Extracto de levadura comercial Ye (g e /g azúcar consumida)            0.36                               0.35                                 0.50 Yg (g g/g ac)                             0.13                               0.12                                 0.12 Yb (g b/g ac)                             0.05                               0.05                                 0.09   CONCLUSIONES Resulta técnica y económicamente factible el reemplazo del extracto de levadura como aditivo nutritivo para la fermentación. Se desarrollaron dos suplementos inorgánicos definidos y sencillos. No hubo diferencias significativas en cuanto al desempeño de las levaduras para los diferentes suplementos minerales estudiados. El consumo de azúcares fue total en tiempos inferiores a 14 hs. Si bien los rendimientos en etanol y biomasa fueron superiores en los ensayos con extracto de levadura comercial respecto a los suplementos minerales, los bajos costos de las sales compensan largamente la economía global del proceso.