A de-immunization strategy to produce functional variants of hyperglycosylated interferon alpha 2b

EDUARDO MUFARREGE; SOFIA GIORGETTI; MARINA ECHEVERRIGARAY; FRANCES TERRY; WILLIAM MARTIN; ANNE DEGROOT

Cocoyoc, Morelos

Congreso; VII Simposio Latinoamericano de Tecnología de Cultivos Celulares (SLATCC); 2016

Instituto de Biotecnología de la UNAM

Los interferones alfa son un grupo de proteínas que pertenecen a la familia de interferones tipo I, usados ampliamente por su potente actividad antiviral y en la terapia contra el cáncer. Sin embargo, la administración prolongada de IFN-alfa 2 o IFN-β1, puede resultar en un quiebre de la tolerancia inmunológica a antígenos propios en algunos pacientes, dando como resultado la producción de anticuerpos anti-IFN. Estos anticuerpos pueden unirse a la molécula de IFN sin producir prácticamente efecto, o pueden provocar alteraciones tanto en la farmacocinética de la citoquina como en su actividad biológica, llegando incluso a neutralizarla. Los resultados de numerosos estudios clínicos han demostrado que el desarrollo de anticuerpos anti-IFN-alfa se produce con frecuencia en pacientes con hepatitis C crónica o enfermedades neoplásicas, tratados con IFN-alfa 2a o IFN-alfa 2b. La incidencia de la producción de anticuerpos anti-IFN-alfa es muy variable y ha sido reportado que ronda entre 7 y 60%.En el presente trabajo nos propusimos analizar la inmunogenicidad de IFN-alfa-2b-4N, una versión hiperglicosilada de IFN-alfa-2b desarrollada hace unos años en nuestro laboratorio. Esta versión exhibe virtudes notables en comparación con la molécula sin modificar, entre las que se destacan una mayor vida media en suero y una mejor relación entre las actividades anti-viral y antiproliferativa. Estas características sitúan a IFN-alfa-2b-4N como un gran candidato terapéutico en la industria farmacéutica. Sin embargo, los resultados de un análisis in silico de la versión hiperglicosilada del IFN-alfa-2b indican que esta variante presenta mayor contenido de epitopes T que la versión wylde type (IFN-WT). Con el objetivo de producir versiones deinmunizadas y funcionales de IFN-4N se aplicó la estrategia DeFT (Deimmunization of Functional Therapeutics), tendiente a desarrollar una terapia de IFN más segura y eficiente.Empleando el algoritmo de re-diseño de proteínas Optimatrix, del set de herramientas ISPRI (Interactive Screening and Protein Reengineering Interface), se logró optimizar la secuencia del IFN-4N, reduciendo la unión entre los epitopes promiscuos y las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Luego de la verificación de las predicciones por medio de ensayos de HLA-binding, ocho modificaciones fueron seleccionadas e integradas en tres variantes de la citoquina: IFN-alfa-2b-4N (VAR1) [5]; IFN-alfa-2b-4N (VAR2) [8] e IFN-alfa-2b-4N (VAR3) [3]; la cantidad de modificaciones está señalada por el número entre corchetes. La versión con ocho mutaciones, IFN-alfa-2b-4N (VAR2), no presentó actividad antiviral in vitro, por lo que no fue incluida en los siguientes ensayos. Por otro lado, los perfiles de citoquinas Th1 y Th2 obtenidos a partir de ensayos de linfoproliferación revelaron una reducción en la imunogenicidad de las proteínas IFN-alfa-2b-4N (VAR1) e IFN-alfa-2b-4N (VAR3), con respecto a los controles (la proteína comercial, no glicosilada IFN-alfa-2b-NG, la proteína comercial pegilada IFN-alfa-2b-PEG, IFN-alfa-2b-WT e IFN-alfa-2b-4N). Para el perfil Th1 el ranking de inmunogenicidad, en orden decreciente, fue: IFN-alfa-2b-WT (92,31%) > IFN-alfa-2b-4N (73,08%) > IFN-alfa-2b-NG (53,85%) > IFN-alfa-2b-PEG (38,46%) = IFN-alfa-2b-4N (VAR1) > IFN-2b-4N (VAR3) (26,92%). Para las respuestas de tipo Th2 los resultados fueron: IFN-alfa-2b-NG (61,54) > IFN-alfa-2b-PEG (57,69%) > IFN-alfa-2b-WT (50,00%) > IFN-alfa-2b-4N (19,23%) > IFN-alfa-2b-4N (VAR3) (7,69%) > IFN-alfa-2b-4N(VAR1) (3,85%).A partir de la deinmunización de la proteína N-glicosilada, mejorada en sus propiedades farmacocinéticas respecto de la variante wylde type, fue posible reducir su inmunogenicidad in vitro empleando como herramienta de análisis los ensayos de linfoproliferación y determinación del perfil de citoquinas secretado. Teniendo en cuenta los valores de inmunogenicidad obtenidos para las versiones comerciales del IFN-alfa-2b, las variantes deinmunizadas producidas, IFN-alfa-2b-4N (VAR1) e IFN-alfa-2b-4N (VAR3) parecen ser candidatos prometedores para su empleo en terapias antivirales en pacientes con hepatitis C o hepatitis B.