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Introducción y Objetivo: Los interferones alfa son un grupo de proteínas que pertenecen a la familia de interferones tipo I, usados ampliamente por su potente actividad antiviral y en la terapia contra el cáncer. Sin embargo, la administración prolongada de IFN-alfa2 o IFN-beta1, puede resultar en un quiebre de la tolerancia inmunológica a antígenos propios en algunos pacientes, dando como resultado la producción de anticuerpos anti-IFN. Estos anticuerpos pueden unirse a la molécula de IFN de tal manera de no producir prácticamente efecto, o pueden alterar la farmacocinética de la citoquina o, en ciertos casos, neutralizar su actividad mediante la unión a una región de la proteína impidiendo la interacción con su receptor en la superficie celular de las células target. Los resultados de numerosos estudios clínicos han demostrado que el desarrollo de anticuerpos anti-IFN-alfa se produce con frecuencia en pacientes con hepatitis C crónica o enfermedades neoplásicas, tratados con IFN-alfa2a o IFN-alfa2b. La incidencia de la producción de anticuerpos anti-IFN-alfa es muy variable y ha sido reportado que ronda entre 7 y 60%.En el presente trabajo nos propusimos analizar la inmunogenicidad de IFN-alfa2b-4N, una versión hiperglicosilada de IFN-alfa2b desarrollada hace unos años en nuestro laboratorio. Esta versión exhibe virtudes notables en comparación con la molécula sin modificar, entre las que se destacan una mayor vida media en suero y una mejor relación entre las actividades anti-viral y antiproliferativa. Estas características sitúan a IFN-alfa2b-4N como un gran candidato terapéutico en la industria farmacéutica y es el motivo por el cual nos propusimos realizar un estudio comparativo de su inmunogenicidad que incluya las variantes comerciales de dicha citoquina. Materiales y Métodos: Los ensayos ex vivo que permiten analizar la inmunogenicidad de proteínas de uso terapéutico involucran, en general, la incubación directa de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana con la proteína de interés y la cuantificación de citoquinas en el sobrenadante de cultivo. Sin embargo, debido a la actividad antiproliferativa del IFN-alfa2b el protocolo mencionado no resulta apropiado. Por este motivo, abordamos una plataforma experimental que incluyó la generación de células dendríticas capaces de endocitar, procesar y presentar los péptidos derivados del IFN a los linfocitos T autólogos. Una manera de obtener células dendríticas es a partir del cultivo de monocitos, que son aislados de las muestras de CMSP debido a su adherencia preferencial al plástico de las placas de cultivo. Luego, los monocitos son diferenciados mediante un cóctel de citoquinas que incluye GM-CSF e IL-4. Posteriormente, estas células son incubadas en presencia del antígeno (en este caso las distintas variantes del IFN). Seguidamente, se induce la maduración de las células dendríticas con el agregado de TNF-alfa al medio de cultivo. De esta forma se obtienen células dendríticas maduras presentando diversos péptidos derivados del IFN, capaces de interaccionar con linfocitos T. Estos linfocitos reconocen el antígeno presentado en la superficie de las células dendríticas y tiene lugar su activación, proliferación y diferenciación, secretando diferentes tipos de citoquinas según el perfil de respuesta desarrollado. En particular, los perfiles linfocitarios analizados en el presente trabajo fueron Th1 y Th2, por ser los observados con mayor frecuencia en estudios previos con otros terapéuticos. El primero es caracterizado por la producción de IFN-gamma y el segundo por la secreción de IL-4. Estas citoquinas fueron cuantificadas mediante ensayos de ELISA sándwich previamente puestos a punto en nuestro laboratorio. Las concentraciones de estas citoquinas se compararon con los niveles de los controles negativos (células dendríticas incubadas con PBS o excipientes y enfrentadas con linfocitos). Por último se calculó la media geométrica de las productividades relativas y se consideró respuesta positiva a productividades relativas de IFN-gamma o IL-4 mayores que la media geométrica. Luego, el porcentaje de respuestas para la proteína analizada se determinó a partir de la suma de respuestas positivas divido el número de donantes analizados multiplicado por 100. El ensayo se realizó con cuatro variantes de la proteína de interés: rhIFN-alfa2b-NG (no glicosilado), rhIFN-alfa2b-WT (O-glicosilado), rhIFN-alfa2b-4N y rhIFN-alfa2b-PEG (pegilado); siendo la primera y última de estas proteínas alternativas comerciales. La población analizada consistió en muestras de CMSP provenientes de sangre periférica de 26 donantes sanos voluntarios (aproximadamente 250 ml de sangre por donante) purificadas mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque y sucesivos lavados. Una pequeña alícuota de la sangre entera de cada donante fue empleada para realizar la tipificación del alotipo de las moléculas del CMH Clase II HLA-DRB1 mediante la tecnología Luminex. Resultados: Por un lado, los resultados obtenidos a partir de la tipificación de las muestras de sangre periférica indican que existe un elevado grado de correlación entre la frecuencia de los alotipos de la molécula HLA-DRB1 en la población mundial y en nuestra cohorte.Con respecto al análisis de la inmunogenicidad, la respuesta in vitro hacia rhIFN-alfa2b-WT estuvo fuertemente polarizada hacia un perfil Th1 (87,5% de respuestas positivas), dado que el porcentaje de respuestas positivas para IL-4 fue relativamente bajo (20,83%). Asimismo, al analizar el porcentaje de respuestas obtenidas al tratar las células con rhIFN-alfa2b-4N, se observó una polarización hacia el perfil secretor de IFN-gamma, similar a lo que se observa en las muestras estimuladas con rhIFN-alfa2b-WT, pero en una magnitud menor (50% de respuestas positivas para IFN-gamma y 4,17% de respuestas positivas para IL-4). Cuando se realizaron las incubaciones con rhIFN-alfa2b-PEG, se obtuvo un mayor porcentaje de respuestas positivas para IL-4 (54,17%) que para IFN-γ (25%). Esto sugiere que la respuesta hacia el rhIFN-alfa2b-PEG sería predominantemente de tipo Th2. Además, al comparar los resultados obtenidos con las proteínas comerciales se puede observar que la proporción de respuestas positivas de tipo Th2 fue similar en ambos casos, con un mayor porcentaje de respuestas positivas de tipo Th1 hacia el rhIFN-alfa2b-NG. Finalmente, a partir de los ensayos realizados se pretendió analizar el porcentaje de respuestas T efectoras inducidas por cada proteína, sin discriminar el tipo de perfil desarrollado. El orden de inmunogenicidad obtenido fue: rhIFN-alfa2b-WT (91,67%), rhIFN-alfa2b-NG (75%), rhIFN-alfa2b-PEG (62,50%), rhIFN-alfa2b-4N (54,17%). Conclusiones: A partir de la tipificación de los alelos HLA-DRB1 en la cohorte analizada, y de la comparación de la proporción de estos alotipos con su frecuencia en la población mundial, se pudo observar un elevado grado de similitud entre las mismas. Esto reviste una gran importancia cuando se pretende analizar la inmunogenicidad de un terapéutico con intenciones de ser administrado en pacientes a escala mundial.-A pesar de la actividad antiproliferativa del rhIFN-alfa2b, fue posible elaborar un protocolo de linfo-proliferación a partir de las muestras de CMSP, que permitió analizar la inmunogenicidad de las distintas variantes de la citoquina. -En este sentido, las proteínas rhIFN-alfa2b-WT y rhIFN-alfa2b-4N mostraron una polarización de la respuesta in vitro hacia el perfil Th1, mientras que las respuestas hacia la variante rhIFN-alfa2b-PEG fueron predominantemente de tipo Th2. En el caso de la proteína rhIFN-alfa2b-NG ambos tipos de respuestas fueron observados.-Del análisis de las respuestas positivas (sin discriminar el tipo de perfil desarrollado) se desprende que rhIFN-alfa2b-4N es una variante que presenta una menor inmunogenicidad en comparación con las versiones comerciales. Teniendo en cuenta esto y considerando las características mejoradas de la variante hiperglicosilada se concluye que rhIFN-alfa2b-4N constituye una alternativa promisoria para la industria farmacéutica.-Finalmente, si bien en el presente trabajo se abordó el análisis de la inmunogenicidad del IFN-alfa2b, la plataforma experimental propuesta resulta versátil y extrapolable a otros bioterapéuticos como etapa del control de calidad de los mismos.

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