GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NUEVAS LÍNEAS CELULARES ANIMALES OPTIMIZADAS PARA LA SOBRE-EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE USO TERAPÉUTICO

EVANGELINA BENIZIO; FABRICIO CHIAPPINI; MARINA ECHEVERRIGARAY; RICARDO KRATJE; CLAUDIO PRIETO; EDUARDO MUFARREGE

Santa Fe

Congreso; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Introducción: La optimización de un proceso de producción de proteínas recombinantes, que emplea células animales como plataforma, se puede llevar a cabo mediante la manipulación de cuatro componentes esenciales: los vectores de expresión, la célula productora, el sistema y el medio de cultivo. Las tecnologías que involucran la manipulación genética de la célula productora, en general, consisten en el silenciamiento o la sobre-expresión de genes implicados en el metabolismo, la apoptosis y la proliferación celular. En particular, en este trabajo se ha desarrollado una estrategia de ingeniería celular que se basa en la sobre-expresión de la proteína P (por razones de confidencialidad) involucrada en la regulación de la expresión génica a nivel post-transcripcional en las células CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary) y HEK-293T (Human Embryonic Kidney). Las nuevas líneas celulares obtenidas fueron evaluadas en diversos aspectos tales como: morfología, crecimiento, metabolismo celular y productividad específica de proteínas recombinantes humanas de interés biotecnológico. Metodología: La secuencia codificante de la proteína P fue digerida con enzimas de restricción y clonada en un vector de expresión adecuado previamente tratado con las mismas enzimas. El vector recombinante obtenido fue empleado para realizar ensayos de transfección, utilizando el reactivo lipofectamina. Las líneas celulares transgénicas CHO-K1 y HEK-293T fueron tratadas con el antibiótico zeocina con el fin de eliminar aquellas células que no incorporaron el transgen de interés. Una vez verificada una muerte celular completa de las células wild type (wt), se realizó un clonado celular por medio del método de dilución límite. La selección clonal se llevó a cabo a partir de la capacidad de las células para expresar la proteína reportera eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein). La estrategia empleada contempló la generación de partículas lentivirales que contenían la secuencia del gen reportero y ensayos de transducción con la misma multiplicidad de infección (MOI) para cada caso. Mediante citometría de flujo se cuantificaron los niveles de sobre-expresión de la proteína eGFP. Estos clones fueron luego evaluados en relación a los niveles del transgen P mediante ensayos de RT-qPCR relativa, empleando oligonucleótidos específicos y genes housekeeping adecuados. Asimismo, los niveles de proteína P fueron confirmados mediante experimentos de Western Blot empleando un anticuerpo policlonal comercial y un protocolo desarrollado en nuestro laboratorio. La morfología celular se evaluó mediante microscopia realizando preparados frescos de cada clon celular y comparada con la de la línea no modificada. A tal efecto se empleó un microscopio invertido de fluorescencia (Nikon Eclipse Ti). El crecimiento y la viabilidad celular se determinaron mediante recuentos en cámara de Neubauer durante 10 días de cultivo. El perfil metabólico de las líneas y clones celulares se llevó a cabo mediante la determinación del consumo de glucosa y la producción de lactato y amonio empleando kits comerciales basados en métodos enzimáticos (Sociedad de Bioquímicos, Argentina). Con el fin de determinar la capacidad productiva de proteínas de uso terapéutico, los clones y líneas de interés fueron transfectadas con vectores de expresión que incluían las secuencias codificantes para las proteínas Interferón alfa 2b (rhIFN-2b) o Eritropoyetina humana (rhEPO) recombinantes. Las células transfectadas fueron tratadas con antibióticos adecuados de manera tal de seleccionar en forma exclusiva aquellas células que incorporaron los vectores mencionados. Posteriormente se sembraron las células productoras a igual densidad y se evaluaron los sobrenadantes de cultivo 24 hs post-siembra, mediante protocolos de ELISA sándwich desarrollados en nuestro laboratorio. Resultados: La metodología de screening por medio de citometría de flujo permitió identificar clones con distintos niveles de la proteína eGFP (entre dos y tres veces superiores a los del control en el caso de células HEK-293T). Con aquellos clones de elevada expresión se realizó una cuantificación de los niveles de transcripto P. De esta manera se pudo verificar que los clones y la línea analizados presentaban niveles de sobre-expresión entre dos y siete veces superiores con respecto a los de la línea wt. Cabe destacar que resultados similares se obtuvieron al llevar a cabo este estudio en células CHO-K1 que sobre-expresaban P. Mediante ensayos de Western Blot se confirmaron los mayores niveles de proteína P en los clones recombinantes de ambas líneas celulares. Por otra parte, por medio de la observación de las células en cultivo se pudo verificar que la sobre-expresión de la proteína P produjo cambios significativos en la morfología celular, presentando los clones transgénicos un mayor tamaño con respecto a las células no modificadas. En cuanto al crecimiento y análisis metabólico, los clones HEK-293T que sobre-expresaban P no presentaron diferencias significativas con respecto a la línea wt. En cambio, los clones recombinantes de las células CHO-K1 presentaron una velocidad de crecimiento mayor pero las densidades celulares alcanzadas durante la fase exponencial fueron menores. Asimismo, las tasas de consumo/producción de metabolitos fueron superiores en comparación a la línea sin modificar. Finalmente, en relación a los ensayos de productividad específica de rhIFN-2b y rhEPO, se encontró que los clones recombinantes mostraron niveles de productividad de hasta tres veces superiores a los alcanzados por las células no modificadas. Conclusiones: Por medio de una estrategia de ingeniería celular se pudieron generar clones de células HEK-293T y CHO-K1 optimizadas para la sobre-expresión de proteínas recombinantes de uso terapéutico humano. Dichos clones no sólo mostraron productividades específicas superiores de rhIFN-2b y rhEPO, sino además mostraron una muy buena performance en cultivo. En conclusión, la tecnología abordada en el presente trabajo resulta novedosa y sumamente promisoria para su aplicación en un proceso productivo de proteínas de uso terapéutico humano a escala industrial.