"OPTIMIZACIÓN DE VECTORES LENTIVIRALES PARA LA SOBREEXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN FORMA TRANSIENTE Y ESTABLE EN CÉLULAS ANIMALES"

EDUARDO MUFARREGE; SEBASTIÁN ANTUÑA; MARINA ECHEVERRIGARAY; RICARDO KRATJE; CLAUDIO PRIETO

Santa Fe

Congreso; V SIMPOSIO LATINOAMERICANO DE TECNOLOGÍA DE CULTIVOS CELULARES (V SLATCC); 2012

Laboratorio de Cultivos Celulares (LCC) - FBCB - UNL

La sobreexpresión de proteínas recombinantes en células animales en forma transiente o estable constituye un verdadero desafío en el proceso de producción de proteínas con fines terapéuticos. Desde hace tiempo es sabido que las regiones 5´ no codificantes (en inglés 5´UTRs, por untranslated regions) cumplen un rol esencial en la expresión de ciertos genes. Por este motivo, el objetivo fundamental de este trabajo consistió en desarrollar un sistema de expresión que permita alcanzar elevados niveles de producción de una proteína de interés. Para lograrlo, se estudiaron distintas combinaciones de regiones promotoras y regiones 5´UTRs en células CHO-K1, HEK293 y HeLa. Entre los promotores se trabajó con secuencias de origen viral (pCMV) y celular (pEF1-alfa), y las 5´UTR utilizadas fueron las correspondientes a los genes: EF1-alfa humano, EF1-alfa Cricetulus griseus, intrón de CMV y el intrón quimérico proveniente de la combinación del primer intrón del gen beta-globina humana y de la región variable del gen de la cadena pesada de una inmunoglobulina (Iq). En todos los casos se utilizó como proteína reportera la proteína verde fluorescente (GFP) y como proteína de interés al factor VIII de coagulación sanguínea humano (hFVIII). Como sistema de transferencia de material genético se generaron vectores lentivirales de tercera generación para cada combinación. De esta manera, al cuantificar los niveles de GFP, se encontró que la mejor combinación comprendió a la integrada por las regiones pCMV-5´UTR EF1-alfa(Hs) a las 96 h (transiente) y pCMV-5´UTR EF1-alfa(Cg) luego de 30 días (estable). Sin embargo, al evaluar la productividad de rhFVIII los mejores resultados fueron alcanzados utilizando las secuencias pCMV-Iq y pEF1-alfa-Iq. En conclusión, por medio de la combinación de distintas regiones promotoras y 5´UTR se generaron nuevos sistemas de expresión, basados en una plataforma lentiviral, apropiados para la sobre-expresión de proteínas recombinantes en células CHO-K1, HEK293 y HeLa.