Detección de hidratos de carbono en tejidos de la vinchuca Rhodnius prolixus

MIRÓ, MARIA S.; GATICA, L.; PAGLIONE, PA; FRUTTERO, LL

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXVI Congreso Argentino de Histotecnología; 2023

Sociedad Argentina de Histotecnología

La colonia de R. prolixus es mantenida en nuestro insectario y en acuerdo al protocolo para el usode animales en Bioterio aprobado por Res. Dec. 737/2021 de la Facultad de Ciencias Químicas(UNC). Se diseccionaron el IM, los ovarios y el cuerpo graso de hembras adultas de R. prolixus a los3 días post alimentación y se fijaron durante 24 h a temperatura ambiente en 10 ml de Fijador deBouin (Biopack) contenidos en frascos de vidrio color caramelo de capacidad 50 ml. Luego, lasmuestras fueron colocadas en cassettes histológicos reforzando la contención del tejido con papelde seda y gasa y se procedió a lavar con abundante agua corriente (20 min). A continuación, lasmuestras fueron sometidas a un procesamiento histológico manual según el siguiente protocolo:Día 1, Deshidratación y Aclarado: Etanol 50% (20 min), Etanol 70% (20 min), Etanol 96% (20 min),Etanol 100% “1” (30 min), Etanol 100% “2” (30 min), Etanol 100:Xileno 1:1 (15 min), Xileno “1” (40min), Xileno “2” (40 min), Parafina Blanda (10 min). Día 2, Infiltración de Parafina: Parafina Blanda(15 min), Parafina Dura I (40 min), Parafina Dura II (40 min). Posteriormente, se confeccionaron losrespectivos tacos de parafina y se obtuvieron cortes de 4 µm de espesor empleando el micrótomode rotación manual Thermo Scientific HM 325. Los cortes fueron luego desparafinados e hidratados según el siguiente esquema: Xileno “1” (7 min), Xileno “2” (7 min), Etanol 100% “1” (5 min), Etanol 100% “2” (5 min), Etanol 96% “1” (5 min), Etanol 96% “2” (5 min), Etanol 70% (5 min), Etanol 50% (5 min), Agua destilada (5 min). Para la tinción de Hematoxilina-Eosina (H-E) se empleó Hematoxilina activada (Biopur) durante 40 seg. Luego se efectuó el viraje de color en agua corriente durante 3 min. A continuación, se colocaron los cortes en solución de eosina alcohólica durante 1 min 40 seg, se deshidrató en una serie de alcoholes etílicos de concentración creciente y finalmente se los montó con Bálsamo de Canadá (Biopack) y cubreobjetos. Para la tinción de PAS se empleó el kit de Biopack según protocolo del fabricante. Posteriormente, se tiñó con Hematoxilina activada y se realizó la deshidratación y el montaje como se indicó para la coloración de H-E. Las imágenes fueron obtenidas en el escáner histológico PhenoImager Fusion (Akoya Biosciences) y el microscopio Eclipse TE2000-U (Nikon).RESULTADOSLa metodología empleada resultó satisfactoria tanto para la obtención de los cortes como para laaplicación de las coloraciones. A partir de la coloración de H-E, se pudieron observar y distinguirclaramente las estructuras tisulares y celulares del IM anterior y posterior, el tejido ovárico y elcuerpo graso. La coloración de PAS-Hematoxilina resultó positiva en la región subepitelial del IM,así como en la membrana perimicrovilar, mientras que, en el cuerpo graso, fueron PAS-positivas lasestructuras que rodean los lóbulos de este tejido, coincidentes con la matriz extracelular rica englicoproteínas. En el caso del ovario, las principales estructuras PAS-positivas se evidenciaron en elinterior del folículo ovárico, en los gránulos de vitelo y en los depósitos de la fosfolipoglicoproteínavitelina.CONCLUSIONESEl presente trabajo describe los protocolos para realizar el procesamiento histológico y tinciones de IM, cuerpo graso y ovario de R. prolixus, lo cual permite el estudio morfológico e histoquímico deestructuras relevantes implicadas en el ciclo de infección de T. cruzi y en el ciclo de vida del vector.El IM de R. prolixus es el principal órgano del tracto digestivo en el cual se lleva a cabo la digestión y la absorción de nutrientes siendo a la vez crítico para el ciclo de infección de T. cruzi (Billingsley,1988). Ha sido observado en otras especies de hematófagos que la presencia de estructuras PAS-positivas varía en los distintos segmentos del IM y en función del estado nutricional del insecto(Rocha, 2010). A su vez, ha sido descripta la presencia de hidratos de carbono en la composición de la vitelogenina y de la vitelina en triatominosas (Salomón y Stoka, 1986). Cabe destacar que además de su importancia en la epidemiología de la enfermedad de Chagas, R. prolixus constituye un importante modelo de estudio debido a su fácil mantenimiento, acceso a la secuenciación de sugenoma y a la posibilidad de sincronizar su fisiología en función de su alimentación. Estos hallazgos sirven de base para futuros estudios centrados en la respuesta de estos tejidos y del contenido de hidratos de carbono en los mismos ante diferentes agentes tóxicos destinados al control vectorial en la enfermedad de Chagas.