Fotoinactivación de biofilms de Candida tropicalis por fotosensibilizadores de origen natural: rubiadina y 1-metil éter de rubiadina

JULIANA MARIONI; JOSE LUIS CABRERA; MARIA G. PARAJE; SUSANA NUÑEZ MONTOYA

Tucuman

Workshop; Workshop ?Inactivación Fotodinámica de Microorganismos y Terapia Fotodinámica?; 2016

Un enfoque que se está desarrollando para el tratamiento de infecciones, es la terapia fotodinámica antimicrobiana (TFDA), en la cual una sustancia fotosensibilizante se activa por la luz, y en presencia de oxígeno presenta la capacidad de aumentar la generación de especies reactivas del oxígeno (ERO), que producen estrés oxidativo en el microorganismo.1 Por lo tanto, la búsqueda de nuevos fotosensibilizadores (FS) es un área de investigación con amplio desarrollo en la actualidad.2 En este sentido, nuestro equipo de trabajo estudia un grupo de 9,10-antraquinona naturales (AQ) con propiedades fotosensibilizantes y su potencial uso en TFDA.Las especies de Candida son las levaduras más comúnmente asociadas a infecciones intra-hospitalarias (IIH), causando tanto infecciones superficiales como sistémicas.3 La resistencia conocida de Candida spp. a la terapia antimicótica convencional es un fenómeno multifactorial complejo, en donde el desarrollo de biofilms es una de las principales causas asociadas a infecciones persistentes, ya que este modo de crecimiento exhibe una baja respuesta a las drogas antifúngicas habituales.4 Aunque C. albicans es la principal agente etiológico de IIH, C. tropicalis ha sido señalada como una de las levaduras patógenas más prevalentes en candidiasis nosocomial en los últimos años, especialmente en América Latina.5 Rubiadina (RUB) y rubiadina-1-metil éter (RubME) son dos AQs aisladas de la planta fototóxica Heterophyllaea pustulata Hook f. (Rubiaceae).6 Esta especie vegetal crece en la región andina del noroeste de Argentina y Bolivia, donde se conoce popularmente como "cegadera", "ciegadera" o "saruera".7Previamente, establecimos que estas dos AQs poseen propiedades fotosensibilizantes. Ambas aumentan la producción de anión superóxido radical (O2?¯) bajo irradiación (fotosensibilización Tipo I). Sin embargo, sólo RUB incrementa la generación de oxígeno singlete (1O2) (fotosensibilización Tipo II).8,9Resultados recientes de nuestro laboratorio han revelado que la foto-activación de un extracto obtenido de esta especie vegetal, que contiene estas dos AQs, produce una reducción de 39,31 ± 3,50 % (% R) en el crecimiento del biofilm de C. tropicalis. También establecimos que la concentración máxima que inhibe al biofilm fue de 0,2 mg/mL, la cual se define como la concentración inhibitoria de biofilms (CIB).10La evaluación del efecto antifúngico in vitro de RUB y RubME sobre biofilms de C. tropicalis, demostró que ambas AQs reducen el crecimiento de éste sólo bajo irradiación, siendo la CIB de 1,96 µg/mL para RUB (CIMx2) con un 63,5 ± 4,4 % de reducción (%R) y 15,6 µg/mL para RubME (CIM) con un 47,0 ± 10,0 %R. AnfotericinaB 61,1 ± 4,1 %R a su CIM. Asimismo, establecimos que la reducción del biofilm se correlaciona con un significativo incremento en la producción de O2?- e especies reactivas del nitrógeno (ERN); observándose que la enzima superóxido dismutasa (SOD) no está activa, pero se produce un incremento del sistema antioxidante total (enzimáticos y no enzimáticos). Por otro lado, por comparación de la intensidad de las señales de fosforescencia del 1O2, observamos que RubME generó 3 veces más 1O2 que RUB en el biofilm incubado con PBS deuterado; sin embargo, no fue posible determinar el estado triplete de ninguna de las AQs en el biofilm debido a los bajos valores de vida media obtenidos para el 1O2 (64 µs para RubME vs. 56 µs para RUB). Con el fin de establecer el mecanismo fotodinámico que predomina en el efecto observado, se evaluó la acción de desactivadores específicos. El efecto antibiofilm de ambas AQs no fue modificado por azida de sodio (500 mM), mientras que fue totalmente revertido por tiron (500 mM). Simultáneamente, la producción de O2?- generó una activación importante de la SOD, que no se modificó en presencia de azida, pero disminuyó a valores basales con tiron. A través de un ensayo de acumulación, nosotros establecimos que RubME posee mayor capacidad para acumularse en el biofilm que RUB, logrando una acumulación del 22.4 ± 4.4 % vs 1.22 ± 0.01% con respecto a la concentración inicial y después de 3h de incubación. En función de esto, el biofilm tratado con ambas AQs fue irradiado durante 15 min a distintos tiempos de incubación (0, 3, 6, 24, 27 y 30 h), lo cual mejoró el efecto de RubME, ya que logró un 62,9 ± 7,4 %R. Asimismo, a las 3 h de incubación sólo se detectó la presencia del radical anión de RubME. Teniendo en cuenta estos resultados y sabiendo que el % de acumulación de RubME es mucho mayor que para RUB a las 3 h de incubación, podríamos estimar que la incorporación de RubME en el biofilm, favorece la formación del intermediario radical anión; y por lo tanto, la formación de O2?-.La combinación de cada AQ con ANFB bajo la acción de la luz, demostró sinergismo parcial (FICI = 0,75; 65 %R) para la combinación de RUB SubCIM y ANFB SubCIM; y adición (FICI = 1, 73 %R) para la combinación RubME SubCIM y ANFB SubCIM. Las combinaciones de ambas AQs sólo fueron activas bajo irradiación, alcanzándose sinergismo parcial cuando se combinaron a la SubCIM (FICI = 0,75, 74%R). Todas estas combinaciones produjeron incrementos significativos en los niveles de ERO y ERN, con la consecuente activación de los sistemas antioxidantes. En conclusión, la actividad antifúngica in vitro de RUB y RubME sobre biofilms de C. tropicalis es mediada principalmente por el mecanismo fotodinámico Tipo I (Producción de O2?-), el cual también estimula el estrés nitrosativo; sin embargo, la activación del sistema antioxidante total no permitió la eliminación total del biofilm. Asimismo, se observó que períodos consecutivos de irradiación incrementan el efecto antibiofilm, en función de la capacidad de acumulación del FS en el biofilm. Y ambas AQs fotosensibilizadas podrían utilizarse desde concentraciones SubCIM para potenciar la actividad de ANFB sobre biofilms de C. tropicalis, como así también combinadas entre sí.1.P. Calzavara-Pinton, M. T. Rossi, R. Sala, M. Venturini. Photochem Photobiol., 2012, 88, 512?522. 2.M. Rajendran. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 2016, 13, 175?187.3.M. Nucci, F. Queiroz-Telles, A. M. Tobón, A. Restrepo, A. L. Colombo. Clin. Infect. Dis., 2010, 51, 561?570.4.G. Ramage, R. Ranjith, S. 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