Caracterización de las propiedades de unión in vitro de FaPG1, FC-FaPG1 y FN-FaPG1 a ácido poligalacturónico

SALINAS, COREL AINARA; PERINI MAURO ALEJANDRO; MARTINEZ, GUSTAVO ADOLFO; CIVELLO, PEDRO MARCOS

Santiago del Estero

Congreso; II Congreso Argentino de Biología y Tecnología Poscosecha; 2019

Universidad Nacional de Santiago del Estero - UNSE. Facultad de Agronomía y AgroindustriaS

El ablandamiento excesivo de los frutos carnosos limita su vida poscosecha influyendo en lapreferencia de los consumidores. La pérdida de firmeza se debe, entre otros factores, aldesensamblaje de la pared celular. En frutilla (Fragaria x ananassa Duch.) dichoablandamiento está estrechamente ligado al metabolismo de pectinas. Se ha demostradoque la supresión de la expresión del gen de poligalacturonasa 1 de frutilla (FaPG1), enzimaque hidroliza pectinas, retrasa el ablandamiento del fruto. La mayoría de las glicosilhidrolasas tienen una arquitectura molecular formada por un sitio catalítico, un módulo deunión a carbohidrato y un péptido señal que las dirige a pared celular. En el caso de laspoligalacturonasas se ha descripto un dominio catalítico, pero no se han caracterizado laspropiedades de unión a carbohidratos de pared celular ni se ha descripto la existencia de unmódulo de unión a carbohidratos. En este trabajo clonamos y expresamos la proteínaFaPG1 y dos fragmentos de esta, FC-FaPG1 (región que contiene el dominio endopoligalacturonasa y FN-FaPG1 (fragmento no catalítico complementario a FC-FaPG1), en unsistema de expresión heterólogo (Escherichia coli), obteniéndose como cuerpos deinclusión. Dichas proteínas se purificaron con una columna de afinidad a niquel. En unprincipio trabajamos para poder estabilizar las proteínas mediante técnicas de diluciónrápida (del inglés: flash dilution) en distintos buffers de distinto pH y fuerza iónica para luegopoder ensayar las propiedades de unión a distintos componentes de la pared celular. Lastres proteínas recombinantes, solubles en buffer con agente caotrópico, utilizado en lapurificación, precipitaron cuando se intentó remover dicho agente por dilución rápida. Sinembargo, logramos estabilizar a la proteína completa y a ambos fragmentos en presencia desu sustrato: ácido poligalacturónico (APG). Luego, buscamos la condición óptima deestabilización: para ello, probamos incubar las tres proteínas con distintas concentracionesde APG, con distintos hidrolizados térmicos de APG y bajo distintos tiempos de incubacióncon APG. En todos los casos el tiempo de incubación óptimo fue de 30 minutos,observándose que el dominio catalítico disminuye su estabilidad a tiempos mayores,mientras que las otras proteínas se mantienen estables en todos los tiempos ensayados.Por otro lado, evidenciamos que menores grados de hidrólisis son mejores para laestabilización. Por último, observamos que: la proteína completa permaneció estable a muybajas concentraciones de APG (60% estable a 0,01%P/V APG); el dominio catalítico perdióabruptamente su estabilidad a concentraciones intermedias de APG (0,05%P/V APG); y elfragmento no catalítico permaneció estable aún a bajas concentraciones de APG (40%estable a 0,025%P/V APG). Estos resultados sugieren que el sustrato interacciona nosolamente con el fragmento catalítico, sino también con la región no-catalítica.