Aislamiento y caracterización de nuevos inhibidores de tripsina a partir de semillas de Gleditsia triacanthos L.(Leguminosae) y de Acer negundo L. (Aceraceae)

PERINI MAURO ALEJANDRO; SIN, IGNACIO NICOLAS; LÓPEZ LAURA; NATALUCCI CLAUDIA; COVALEDA, GIOVANNY; TREJO, SEBASTIÁN A.

Congreso; 8 Congreso Internacional de Biotecnología Vegetal; 2011

Una regulación precisa de la actividad proteolítica tanto espacial como temporal es esencial para la fisiología humana, razón por la cual muchas proteasas se han convertido en importantes dianas biomédicas. Los inhibidores de proteasas (IPs) de plantas son estructuras peptídicas pequeñas, que generalmente se encuentran en alta concentración en tejidos de almacenamiento. Se han descripto IPs de plantas que actúan frente a proteasas de los principales grupos mecanísticos.Con el fin de aislar nuevos inhibidores peptídicos de tripsina a partir de fuentes vegetales, se recolectaron semillas pertenecientes a diversas especies: Magnolia grandiflora, Feijoa sellowiana, Ligustrum lucidum, Gleditsia triacanthos, Jacaranda mimosifolia, Phytolacca dioica, Senna spectabilis, Vigna caracalla, Melia azedarach y Acer negundo. Los extractos crudos fueron obtenidos por trituración de las semillas en un medio buffer (20 g/100 ml) de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2, conteniendo NaCl 0,5 M y ácido ascórbico como antioxidante. Posteriormente, se emplearon microcolumnas de tripsina-agarosa para purificar por cromatografía de afinidad los extractos vegetales y ensayar en los eluatos la presencia de actividad inhibitoria. Este método permitió de manera rápida y eficiente la detección y purificación parcial de nuevos inhibidores de tripsina. La determinación de actividad inhibitoria de tripsina fue llevada a cabo empleando el sustrato cromogénico BAPNA (Benzoil L-arginina 4-nitroanilida).Los resultados obtenidos revelaron la presencia de una fuerte actividad inhibitoria en los extractos obtenidos a partir de semillas de G. triacanthos (Leguminosae) y de A. negundo (Aceraceae). Las muestras correspondientes a dichos extractivos fueron purificadas por cromatografía de afinidad, caracterizadas electroforéticamente y sometidas a un segundo paso de purificación por cromatografía en fase reversa (RP-HPLC, C4). En el caso del extracto proveniente de G. triacanthos se detectaron dos fracciones principales con actividad inhibitoria de tripsina que fueron analizadas por MALDI-TOF MS, una de ellas resultó estar constituida por varias formas moleculares de pesos muy cercanos (péptidos de entre 6540- 7710 Da) que podrían corresponderse con inhibidores del tipo Bowman-Birk, en tanto que la otra fracción mostró 3 isoformas (18943, 19029 y 19254 Da) cuyas masas sugieren que sería un inhibidor del tipo Kunitz.El análisis de los eluatos obtenidos por RP-HPLC de la muestra de A. negundo reveló la presencia de 4 fracciones con actividad inhibitoria y una de ellas (11293 Da) resultó ser homegénea al análisis por MALDI-TOF MS, cabe destacar que hasta el momento no se habían reportado inhibidores de proteasas aislados a partir de la familia Aceraceae.Finalmente se determinaron las huellas peptídicas (Peptide Mass Fingerprinting, PMF) de los inhibidores. Los resultados de los espectros de masasobtenidos producto de la digestión tríptica se analizaron con MASCOT y no fueron identificados con ninguno de los inhibidores actualmente depositados en las bases de datos confirmando el hallazgo de nuevos inhibidores peptídicos de tripsina.