Clonado, expresión y caracterización de la dihidroxiacetona quinasa de Trypanosoma cruzi (TcDAK)

GARAVAGLIA, PA; CANNATA, JB; BRUBALLA, AC; GARCIA, GA

Buenos Aires

Congreso; XXV Reunion de la Sociedad Argentina de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2012

Soc. Argentina de Protozoologia- Ministerio de Salud de la Nacion

Bioquímica y Biología Molecular. CLONADO, EXPRESIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA DIHIDROXIACETONA QUINASA DE Trypanosoma cruzi (TcDAK) Garavaglia, Patricia A.1; Cannata, Joaquín 2,3; Bruballa, Andrea C1 y García, Gabriela A1. 1Instituto Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chaben”. 2IIB-INTECH, UNSAM-CONICET. 3CEFYBO Facultad de Medicina-UBA. e-mail: pato_garavaglia@hotmail.com Ensayos preliminares de nuestro grupo de trabajo demostraron que epimastigotes de T. cruzi no eran capaces de desarrollarse en condiciones de difícil acceso a la glucosa presente en el medio de cultivo, a menos que este último se complemente con glicerol como fuente de carbono alternativa. Recientemente, caracterizamos en este parásito una aldo-ceto reductasa (TcAKR) que utiliza dihidroxiacetona (DHA) como sustrato y presenta similitud aminoacídica con la glicerol dehidrogenasa de Sacharomyces cerevisiae. Además, la presencia en la base de datos del Proyecto Genoma de T. cruzi de una secuencia que codifica para una probable dihdiroxiacetona quinasa (DAK) sugieren que la vía de utilización del glicerol en este parásito podría ser similar a la de levaduras. Es decir, el glicerol sería convertido a DHA por la TcAKR y ésta sería fosforilada por la DAK, formando DHAP. La DHAP entraría al glicosoma para continuar con la vía glicolítica. A fin de evaluar esta hipótesis se decidió clonar el gen de la TcDAK y caracterizar esta enzima. El gen de la TcDAK se amplificó por PCR a partir de ADN genómico con primers específicos conteniendo los sitios de restricción para BamHI y EcoRI. Posteriormente, se clonó en el vector pRSET(A) digerido con las mismas enzimas y luego se subclonó en el vector de expresión pQE30 digerido con BamHI/HindIII. La TcDAK recombinante se expresó en E. coli M15 y se purificó por cromatografía de afinidad por IMAC, la misma presentó un peso molecular aparente de 60 kDa y fue reconocida por un suero anti-histidinas por “western blot”. La actividad catalítica de esta enzima se evaluó en presencia de DHA y ATP midiendo la oxidación del NADH a 340 nm en una reacción acoplada con glicerol 3-fosfato dehidrogenasa. La actividad específica de la TcDAKrec fue de 545 nmoles de NADH/min/mg. En futuros ensayos se intentará establecer las condiciones óptimas para la medición de actividad de glicerol dehidrogenasa de la TcAKR en un sistema acoplado con la TcDAK.